辛伐他汀促进伴骨吸收慢性根尖周炎骨质修复的实验研究

郑立娟 汤晨 赵旭

慢性根尖周炎是口腔临床常见疾病，根管治疗为较重要的方法，但对于有些慢性根尖周炎所引起的大面积根尖骨质的吸收，除根尖外科手术外尚缺乏有效的方法，而且骨质吸收后自行愈合的时间较长，为进一步的修复工作带来很多问题[1]。根尖骨吸收的机制尚不清楚，其修复方法，有自体骨移植、异体骨移植、骨移植替代材料等。近年来，药物抑制根尖炎骨吸收为根尖炎的骨质修复开辟了一条新途径。

1999 年Mundy[2]首先提出他汀类药物具有促进骨质生成的作用。辛伐他汀是HMG-CoA的抑制剂,能降低血液中的胆固醇水平，对动脉粥样硬化具有防治作用[3]。后被证明能够诱导骨密度的增加，可刺激成骨细胞的分化和成熟，以及骨形成相关基质的生成的作用，从而有明显促进成骨细胞的生成和抑制骨吸收的双重作用。

关于辛伐他汀促进成骨的实验研究，大多集中在对于体外培养的成骨细胞的影响[4]，近年来将辛伐他汀用于体内骨组织，主要有辛伐他汀对于骨质疏松大鼠模型的成骨作用的影响，可能有保护骨质疏松的作用，但在口腔医学中的相关研究，主要在种植体，正畸领域以及牙周组织改建方面，用于根尖骨国内未见文献报道，国外只有少数研究他汀类药物的抗骨吸收活动[5],本课题通过实验研究论证辛伐他汀用于抑制根尖炎骨质吸收和促进成骨的作用，为他汀类药物用于治疗伴骨吸收慢性根尖周炎骨修复提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8 周龄SPF级SD大鼠32 只，雄性，体重(200±20) g，由大连医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要材料及仪器 大肠杆菌标准内毒素(湛江安度斯生物有限公司)；辛伐他汀原料药(纽拜尔医药科技有限公司)；兔抗鼠BMP2多克隆抗体、DAB显色试剂盒(博奧森生物技术有限公司)；低温高速离心机(nohbimpex technologies Co.ltd,iFuge,HCT,德国)、全自动生化分析仪(迪瑞医疗科技股份有限公司，CS-6400);恒温水浴箱(上海基玮试验仪器有限公司，DK-S28)、扫描电子显微镜(Olympus公司，FV3000,日本)；直接数字化X线成像系统RVG(SOREDX，DIGORA，Optime,芬兰)等。

1.2 实验方法

1.2.1 建立大鼠慢性根尖周炎骨吸收动物模型 将32 只大鼠随机分成4组，分为A组(正常对照组)8 只、B组(模型观察组)8 只，C组16 只，取B组和C组共24 只大鼠，首先将大鼠称重，用10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，仰卧固定上下颌，第一磨牙开髓，置内毒棉球并压紧，动物清醒后，正常饲养。取B组大鼠，于开髓后的第2周末和第3周末分别处死4 只，分离上下颌骨，取牙颌骨联合标本，置于4%的甲醛溶液中固定待用。

1.2.2 建立大鼠辛伐他汀用药模型 于建模手术3 周末根尖炎模型建立成功时，取C2组(辛伐他汀组)大鼠，分别称重，按照20 mg/kg/d剂量的辛伐他汀配成1 ml的溶液灌胃，于第3周末开始，每天1 次，持续2 周。C1组(生理盐水组)每天给予等量生理盐水灌胃，喂药2 周后取A组，C1和C2组于心尖处穿刺取血，至于紫色采血管中静置，离心后取上清液，自动生化分析仪测量血清ALP、Ca、P，处死C1组和C2组，分离上下颌骨组织，取牙颌骨联合标本，置于4%的甲醛溶液中固定，分别用RVG成像系统拍摄X线片[6]。

1.2.3 制作组织病理学切片并进行HE染色 按步骤进行二步法免疫组织化学染色，在光学显微镜下观察，随机选取2 个视野，记录阳性表达细胞计数，计算阳性表达率并摄像。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 实验性根尖周炎骨吸收X线影像分析

术后2 周末，大鼠根尖周组织开始出现低密度的阴影；3 周末时，阴影面积明显增大，此时为根尖周炎症的高峰期。可见，根尖周阴影面积的增宽随着根尖周炎症的不断进展而逐渐变大，疾病发展阶段，根尖阴影面积与时间成正比关系。而至5 周末时炎症吸收趋于稳定，转为慢性，用药灌胃2 周后，生理盐水组大鼠根尖骨吸收阴影面积未见明显改变，辛伐他汀组大鼠根尖骨吸收阴影面积减小，有明显愈合趋势(图 1)。

图 1 各组大鼠上下颌第一磨牙根尖X线片

2.2 血清骨形成相关生化指标的测定

由表 1可见，血清钙在各组间比较：按显著性为0.05的水平，C1组与A组比较P=0.040，C2组与A组比较P=0.023，C2组与C1组比较P=0.795。

表 1 给药前后血清Ca、P、ALP浓度的变化

注： ① 与A组比较，P<0.05； ② 与C1组比较，P>0.05； ③ 与A组比较，P>0.05； ④ 与C1组比较，P<0.05

血清磷在各组间比较：C1组与A组比较P=0.026，C2组与A组比较P=0.515，C2组与C1组比较P=0.316。

ALP在各组间比较：C1组与A组比较差异有显著性(P=0.000)，C2组与A组比较P=0.172，C2组与C1组比较P=0.020。

2.3 实验性根尖周炎组织病理学分析

用双目光学显微镜用×100倍数观察组织病理切片，随机选取2 个视野，观察炎症状态。

实验结果显示，术后2 周末，牙髓组织中可见大量炎症细胞浸润区域并有局部或大部分牙髓坏死，牙周膜间隙可见增宽，根尖周组织开始出现炎症及根尖周牙槽骨开始出现破坏；3 周末时，炎性细胞浸润明显加重，根尖周炎症及牙槽骨破坏明显加重；至第5周末时， 表现为慢性炎症，根尖周骨组织破坏不再加重，周围有纤维组织包绕，局部牙骨质可见增生，而C2组根尖牙骨质及根尖骨增生明显，骨修复现象明显(图 2)。

组织病理学切片按照统一的标准和盲法的原则进行评估。

2.4 BMP2免疫组织化学染色结果分析

BMP2阳性产物定位于细胞核，呈棕黄色， C2组(辛伐他汀组)阳性染色出现于骨细胞、成骨细胞及部分间充质细胞,阳性着色深且广泛， C1组(生理盐水组)阳性染色出现于骨基质表面及骨小梁周围的部分骨细胞、成骨细胞,阳性着色减少；A组(正常对照组)阳性染色少，分散淡染，用Image pro-plus图像分析软件分别计算阳性率(含棕黄色颗粒细胞)并取平均值。A、C1和C2组阳性率分别为(25.0±2.7)%、(45.0±3.2)%和(62.0±5.1)%。C1与C2组分别与A组相比(P=0.000)；C2组与C1组比较(P=0.000)，辛伐他汀组大鼠BMP2阳性表达率明显升高(图 3)。

图 2 大鼠根尖周炎组织学观察 (HE, ×100)

图 3 BMP2在各组大鼠根尖周炎症组织中的表达 (×400)

3 讨 论

慢性根尖周炎主要的病理表现为炎性肉芽组织和牙槽骨破坏。临床上对于根尖周炎的治疗，根管治疗常常获得较好的疗效，但是慢性根尖周炎伴有大面积的骨吸收也较常见，除了根管治疗同时需进行根尖外科手术。这类疾病骨吸收面积大，自行愈合时间较长，为修复工作带来难题，临床上对于慢性根尖周炎导致骨吸收的治疗和促进骨质的愈合在不断探索中。

建立根尖周病的动物模型是研究根尖周病发病机制的重要手段，以此来观察炎症浸润的范围和程度、骨吸收的面积以及各种不同因子在根尖周炎中的表达[7]。也可施加一些干预因素(如药物、激素等)，来观察这些因素对根尖周病的影响。本实验采用内毒素棉球置于髓腔中并开放于口腔自然环境中，这种方法既可使内毒素发挥快速有效的致炎作用，又可使口腔中的混合菌感染牙髓，细菌内毒素(LPS)[8]主要成分为LPS，LPS为炎性刺激物，能够使机体产生一系列的炎症反应和免疫反应，进一步造成病理性损伤，导致骨质吸收等[9]。本实验两周末，3 周末大鼠均可见明显地观察到根尖骨吸收阴影，根尖区牙周膜及硬组织随着根尖炎症的不断进展而出现骨质的吸收破坏，且3 周末阴影面积较两周末明显增大，大鼠根尖周炎模型建模成功，随后炎症吸收趋于稳定，并出现增生修复现象。此种方法可以在周期较短的过程中观察根尖炎的发展和致病机制，这样得到的动物模型与文献报道的其他方法比较，其病变发病较快，周期短，方便快捷且接近于根尖周炎的自然发病过程[10-11]。

他汀类药物为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，辛伐他汀为他汀类药物常用的一种，广泛应用于降低血胆固醇及低密度脂蛋白的水平，可起到预防动脉粥样硬化、降低心血管疾病的发生率的作用。以往研究证实辛伐他汀可影响骨代谢，具有使骨量增加，使骨密度值提高，促进骨形成相关基因的表达。本研究通过口服给药来研究辛伐他汀对于根尖骨组织骨代谢的影响。

血清总碱性磷酸酶 (ALP)是评价骨形成和骨转换的常用指标。ALP与骨矿化过程密切相关，因为碱性的环境有利于骨钙化的过程，使其更为活跃，成骨细胞能够释放ALP，所以碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期指标之一，其表达随着成骨细胞的发展而加强，代表骨形成的状况，本实验中，C2组(辛伐他汀组)在给药2周后，通过大鼠血清检测发现碱性磷酸酶浓度较对照组明显升高，表明成骨细胞处于活跃状态，接近正常对照组，这说明辛伐他汀可明显刺激成骨细胞的增殖和分化，有明显促进骨形成的作用。与沈兰花等[12]采用MTT法、二辛可宁酸法检测辛伐他汀可促进碱性磷酸酶的活性的研究结果相一致。

在以往大鼠实验研究中，他汀类药物可以局部诱导成骨，加快骨修复。通过一系列的分子最终作用于骨形态发生蛋白-2(BMP2),使成骨细胞内BMP2基因表达的增强[13]。

他汀类药物可以通过多条通路、多个连锁环节最终促进BMP2的表达和活性。他汀类药物可以通过以下信号通路促进BMP2表达：如辛伐他汀可以使Smad1和Smad5信号蛋白的表达水平明显增加；还可作用于小GTP-包含蛋白，使eNOS表达增加，增强BMP2的活性；也可通过PI3 K/Akt相关信号通路，增加内皮细胞eNOS-mRNA的稳定性,使eNOS的活性增强，具有使BMP2的表达上调的作用[14]；还可以抑制Rho和Rho激酶的活性，从而导致BMP2的表达上调。还存在一些交叉，如促分裂素原活化蛋白激酶，MAPK信号传导途径和Wnt信号通路[15-16]，辛伐他汀作用于根尖骨修复的分子机制有待进一步研究。

而BMP2是对于骨形成和骨修复具有极强的促进作用的蛋白，它不仅可以促进成骨细胞及其相关前体细胞的增殖，并且具有促进成骨细胞分化的作用，同时具有促进相关间充质细胞分化为成骨细胞，还可诱导具有多种分化潜能的成纤维细胞间质前体细胞转化为成熟的成软骨细胞和成骨细胞，诱导间充质干细胞转化为具有成骨作用能力的细胞，进而发挥成骨细胞强大的成骨作用，增加骨量，修复骨质的微损伤，防治骨质疏松症的发生[17]。同时有文献报道[18]，BMP2可以有效地增加ALP的活性，如前文所述，ALP活性增强，成骨作用增强。本实验在大鼠根尖炎骨吸收动物模型建模成功后，给予辛伐他汀溶液20 mg/kg/d灌服2 周后，取牙颌骨联合标本制作病理切片后进行免疫组织化学染色，发现实验组根尖牙槽骨成骨细胞内可见明显的阳性染色，而对照组仅有少量表达，实验组阳性染色率明显高于对照组，差异有统计学意义。

本实验论证了口服辛伐他汀对于根尖炎骨组织的修复有一定的促进作用。为药物辅助治疗根尖炎骨吸收提供了新的思路。临床上治疗慢性根尖周炎骨吸收目前主要采用根管治疗，必要时配合根尖手术，但有时慢性根尖周炎伴有大面积骨吸收不易愈合或愈合时间较长，为进一步的修复工作带来难题，因观察愈合周期较长，易有牙折及冠部渗漏的可能，影响根管治疗的疗效；若在根尖病灶不愈合进行早期冠修复，则存在一定的风险。所以用药物辅助治疗来促进骨吸收的愈合，可解决以上难题。关于辛伐他汀促进根尖炎骨质的修复的分子机制、作用机理、剂型以及给药方式等还有待于进一步探索。