苦味素受体对大气可吸入颗粒诱导的气道黏液高分泌干预机制研究

刘 峰，周向东 ，李 琪，刘美花，王 杰

（海南医学院第一附属医院呼吸内科，海南 海口 570102）

黏液高分泌是慢性气道炎症的重要病理特征之一，过度分泌且表型异常的黏液常可导致难以缓解的气道梗阻，从而使患者病情加重[1－3]。以往将常用祛痰类中药如桔梗等的作用机制归于恶心刺激效应，但此种解释无明确实验支持。有研究证实，与苦味感知相关的苦味素受体（T2Rs）的激活具有加快黏液纤毛清除效率及舒张支气管等多种积极作用[4－5]。同时，桔梗等苦味中药的主要成分为此类受体的配体，故可考虑此祛痰类中药的作用多为通过苦味素受体来实现。本研究中通过选用具有临床意义的大气可吸入颗粒，即PM2.5（particles with an aerodynamic diameter of less than 2.5 μm）作为实验刺激因素来诱导气道黏液高分泌的产生，探讨了T2Rs对气道上皮细胞黏蛋白（mucin，MUC）5AC蛋白表达的调节作用，可为慢性气道炎症的治疗提供新的思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器：TEOM1405D双通道颗粒物监测仪（美国赛默飞公司，精度为 ± 1.0 μg ／m3）；TECAN sunrise remote 自动酶标仪（奥地利）；TCSSP2激光扫描共聚焦显微镜（德国徕卡）；SW－CJ－2FD型超净工作台（江苏安泰空气技术有限公司）；Smart Spec3000型紫外分光光度计（美国Bio－Rad）；DYY－Ⅲ33型水平电泳仪（北京六一仪器厂）；SWX－600BS型电热恒温水浴箱（上海医疗器械厂）；Z 233MK－2型低温超速离心机（德国Hermle）。

细胞与试药：中药单体化合物桔梗皂苷（西安开来生物工程有限公司，批号为20170829，纯度≥98%）；人气道上皮细胞株HBE16（上海复祥生物科技有限公司，批号为6089）；鼠抗 MUC5AC 45M1单克隆抗体（美国Chemicon公司）；HRP标记羊抗兔多克隆IgG抗体（美国SantaCruz公司）；异硫氰酸（FITC）标记羊抗鼠荧光素IgG，辣根酶标记羊抗鼠IgG（北京中衫金桥生物技术有限公司）；MMLV（重组鼠白血病病毒反转录酶）第一链cDNA合成试剂盒（日本 TaKaRa公司）；兔抗鼠 T2R14多克隆抗体（英国 Abcam公司）；兔抗鼠 MUC5AC，GAPDH一抗（德国Calbiochem公司）。

1.2 方法

细胞培养：将人气道上皮细胞株HBE16置6孔培养板中培养，每孔4×105～5×105个细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液2 mL，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育，常规换液培养，细胞融合至70% ～80%时进行传代。

PM2.5的采集及悬浮液的制作：PM2.5颗粒（河北省环境监测中心所采集于河北省石家庄市新华区石太高速公路附近），所有颗粒物经TEOM1405D双通道颗粒物监测仪滤过，使用虚拟冲击器分离大细颗粒物和PM2.5，然后进入双通道，分别聚集于系统可更换的TEOM滤膜上。收集的PM2.5颗粒加入蒸馏水中，配置成50 g／L的悬浮液，于360℃下热处理60 min，－20℃避光，保存，待用。

细胞分组：将培养结束的细胞分成4组。对照组：在无胎牛血清的1640培养基中继续培养；PM2.5组：在无胎牛血清培养液中加入终质量浓度为 40 μg／mL的PM2.5悬液；PM2.5＋桔梗皂苷组：在无胎牛血清培养液中加入桔梗皂苷，使其终质量浓度为200 mg／L，于24 h后加入终质量浓度为40 μg／mL的 PM2.5悬液；桔梗皂苷组：在无胎牛血清培养液中加入桔梗皂苷，使其终质量浓度为200 mg／L，持续24 h。之后继续培养24 h，再采集细胞进行相关指标检测，每组实验重复6次。

MUC5AC蛋白含量测定：采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞中MUC5AC蛋白含量[6]，按试剂盒说明书进行标准品的稀释和加样。取各样本100 μL，加入96孔酶标板，于4℃湿盒内过夜。胎牛血清室温下封闭 1 h，加入鼠抗 MUC5AC 45M1单克隆抗体（1∶100，用含 0.05%Tween－20的 PBS液稀释至 50 μL），于 37℃下孵育 1 h；加入辣根酶标记羊抗鼠 IgG（1∶10 000）100 μL，孵育1 h；经过四甲基联苯胺过氧化物酶显色，测出各孔吸光度值（450 nm），得出MUC5AC蛋白含量的相对值。

细胞免疫荧光法观察细胞中T2R14和MUC5AC蛋白表达：采用细胞免疫荧光法观察。细胞培养结束后，弃置培养液（PBS）漂洗3次。加入4%多聚甲醛，于室温下固定 30 min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗3次。室温下采用0.4%Triton－X 100反应20 min，PBS液漂洗3次。于室温下加入羊血清工作液，封闭30 min。弃置羊血清液，加入一抗为兔抗鼠T2R14多克隆抗体（1∶500）和鼠抗MUC5AC单克隆抗体（1∶500），于 4℃湿盒内过夜，次日使用PBS液漂洗3次。加入二抗为FITC标记羊抗鼠 IgG（1 ∶50），于室温下置暗盒内孵育 30 min，PBS 液漂洗3次。50%甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。

RT－PCR法检测细胞中 T2R14，MUC5AC mRNA水平[7]：采用Trizol法抽提各组细胞总RNA，测定RNA浓度和在260 nm及280 nm波长处的吸光度值。引物由上海生物有限公司设计合成。各引物序列见表1。PCR反应条件为94℃预变性3 min，紧跟34个循环，循环参数：94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，之后 72 ℃下延伸10 min以补齐末端。酶切产物经过2%琼脂糖电泳鉴定，溴化乙锭显色。结果经Bandleader软件行光密度面积积分分析，以目的基因和GAPDH的光密度面积积分比值来表示。

表1 RT－PCR各目的基因引物序列

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件处理数据，结果采用均数±标准差±s表示，多组间分析使用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞中MUC5AC蛋白含量

与对照组相比，PM2.5组细胞内的MUC5AC蛋白分泌水平明显增高（P＜0.01）。在PM2.5刺激前予桔梗皂苷预处理组细胞内的MUC5AC蛋白分泌水平明显低于单纯的 PM2.5组（P＜0.01）。详见表2。

2.2 T2R14和MUC5AC蛋白表达情况

与对照组相比，PM2.5组细胞内的MUC5AC蛋白表达量明显升高。在PM2.5刺激前予桔梗皂苷组细胞内的MUC5AC蛋白含量低于单纯的PM2.5组，同时T2R14蛋白表达水平升高。与对照组相比，桔梗皂苷组细胞内的T2R14蛋白表达水平同样升高。详见图1和图2。

2.3 T2R14和MUC5AC mRNA转录情况

与对照组相比，PM2.5组细胞内 MUC5AC的mRNA表达水平明显增高（P＜0.01）。PM2.5＋桔梗皂苷组细胞内MUC5AC的mRNA表达水平明显低于PM2.5组（P＜0.01），同时，T2R14的 mRNA 表达水平较对照组升高（P＜0.05）。与对照组相比，桔梗皂苷组细胞内 T2R14的 mRNA表达水平升高（P＜0.05）。详见表2和图3。

表2 各组MUC5AC的蛋白分泌结果和MUC5AC、苦味素受体的 mRNA表达（±s，n＝6）

表2 各组MUC5AC的蛋白分泌结果和MUC5AC、苦味素受体的 mRNA表达（±s，n＝6）

注：与对照组比较， P ＜0.05，＃P ＜0.01；与 PM2.5组比较，P ＜0.01。

组别对照组PM2.5组PM2.5＋桔梗皂苷组桔梗皂苷组MUC5AC的蛋白分泌0.227±0.005 0.779±0.004＃0.378±0.006 0.219±0.003 MUC5AC 0.283±0.009 0.784±0.006＃0.357±0.004 0.268±0.005 T2R14 0.256±0.004 0.243±0.008 0.534±0.006 0.557±0.009

图1 各组T2R14的蛋白表达情况（激光共聚焦显微镜×400）

图2 各组MUC5AC的蛋白表达情况（激光共聚焦显微镜×400）

图3 各组MUC5AC和苦味素受体的mRNA表达水平

3 讨论

气道黏液高分泌是影响气道炎症性疾病发生、发展及预后的重要因素。气道病理性黏液产生的主要原因为黏蛋白的过度表达，至今已发现18种MUC基因，其中MUC5AC的过度表达在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary desease，COPD）患者的病情进展中具有重要的病理意义[8－10]。目前，临床常使用中医中药辅助祛痰治疗，常见的祛痰类中药有桔梗、远志、前胡等，多数含有苦味成分。苦味物质可改善痰液的理化性质，使痰液较易咳出，但其作用机制目前无确切解释。

人对苦味的感知与体内存在的味觉感受器T2Rs的表达有关，已发现25个T2Rs受体亚型，人气道上皮细胞表达较多的是 T2R10，T2R14，T2R31[11－14]。最新研究发现，黄芩苷可使人膀胱平滑肌细胞的T2R14的表达增加，且白果的药效物质有奎宁、芦丁对T2Rs的亚型T2R14受体具有明显的激动作用[15－16]。推测桔梗皂苷可能通过激活人气道上皮细胞T2Rs中的T2R14亚型促进气道黏液的分泌。本研究结果表明，PM2.5刺激后，MUC5AC的蛋白表达及mRNA水平较对照组显著升高，提示PM2.5可以通过诱导MUC5AC高分泌的产生，进而促进气道黏液高分泌的形成。采用桔梗皂苷干预后，MUC5AC的蛋白表达及mRNA水平较PM2.5组下降显著，提示桔梗皂苷对PM2.5诱导产生的MUC5AC高分泌具有抑制作用。各组T2R14的检测结果显示，桔梗皂苷T2R14的蛋白表达及mRNA水平较对照组升高。可见，桔梗皂苷可激活肺部T2R14的蛋白表达，可进一步抑制PM2.5诱导的MUC5AC的高分泌，进而达到抑制气道黏液高分泌的目的。

目前，国内外对肺部T2Rs的研究主要是针对舒张支气管的作用[17]，而较少涉及抗炎作用。本研究结果确认了T2Rs在治疗气道黏液高分泌方面的积极效应。因此提示，T2Rs在治疗气道黏液高分泌方面的巨大潜在价值，进而为慢性气道炎症性疾病气道黏液高分泌的治疗提供了新的诠释机制和药物干预靶点。