从土耳其进境番茄种子上首次截获番茄斑萎病毒

余 辛冯黎霞章 柱武目涛李新浩丁 钿

（1广州机场出入境检验检疫局，广东广州 510000；2广东检验检疫技术中心，广东广州 510000）

番茄（Solanum lycopersicum）是全世界栽培最为普遍的茄果类蔬菜之一，近十年来全世界番茄的消费量以平均每年3%的速度增长。病毒病在世界各国番茄种植区普遍发生，严重威胁番茄的安全生产。目前，危害番茄的病毒有40余种（Hanssen et al.，2010），可通过种子携带的有南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、番茄黑环病毒（Tomato black ring virus，TBRV）等。在这些病毒中，TSWV、ArMV、ToRSV、TBRV等是我国禁止进境的检疫性有害生物。

番茄斑萎病毒是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的代表种，是农业生产上危害非常严重的病毒。Brittlebank（1919）最早在澳大利亚发现TSWV为害番茄，1965年TSWV在大丽菊上被首次分离出来后，研究人员相继从青椒、番茄及多种观赏植物上分离出该病毒。目前TSWV在欧洲、北美洲、南美洲、亚洲和大洋洲等多个国家和地区广泛分布，热带、亚热带、温带地区均有发生，是名副其实的全球性植物病害，被列为世界十大植物病害之一。TSWV的寄主范围十分广泛，能感染超过84科1 090种植物，寄主作物主要有烟草、花生、辣椒、莴苣、茄子等（Parrella et al.，2003）。20世纪80～90年代，TSWV在美国夏威夷、意大利、南非和巴西的流行导致当地的番茄、叶用莴苣（生菜）等作物近乎绝产（Wilson，1998；Pappu et al.，2009；Al-Saleh et al.，2014）。在有些年份，夏威夷莴苣作物因受TSWV破坏，经济损失达50%～90%（Cho et al.，1989）。近些年来，陆续在我国的四川、广州、北京等地多种植物上发现TSWV的危害（许泽永 等，1988；姚革，1992；陈东亮 等，2018）。

近二十年来，基于抗原抗体反应的血清学方法和基于PCR反应的分子生物学方法发展非常迅速，已广泛应用于植物病原菌的检测鉴定中，其中DAS-ELISA和RT-PCR因具有高度的专一性和灵敏度，又可在短时间内得到结果，已成为检测鉴定植物病毒的重要方法（金羽和文景芝，2005）。我国发布的番茄斑萎病毒检疫鉴定国家标准GB/T 31802—2015规定了利用植物叶片进行TSWV检测鉴定的方法和程序，TSWV阳性检出的判定标准为：DAS-ELISA测定为阳性，同时RT-PCR或者实时荧光定量PCR测定为阳性。同时，科研人员也在不断研究并建立快速可靠的TSWV检测方法，Boonham等（2002）运用实时荧光定量PCR技术、吴兴海等（2016）利用恒温扩增技术等建立了TSWV快速检测鉴定技术，刘忠梅等（2017）应用DPO技术建立番茄斑萎病毒检测方法，冯黎霞等（2017）从进境的生菜种子中检测到TSWV。据报道，目前国内外大多是针对番茄感病叶片或果实进行病毒检测，国家标准GB/T 31802—2015中也要求采集叶片用于检测番茄斑萎病毒。直接对番茄种子进行种传病毒的检测鉴定很少（廖富荣 等，2011），也没有直接从番茄种子中检测到TSWV的报道。

本试验以2018年7月自广东口岸进境的土耳其番茄种子为试材，采用研磨的种子进行病毒检测，取样量较大且样品均一性高，利用DASELISA方法初筛鉴定，并进一步进行RT-PCR检测和序列测定，证实该批土耳其进境番茄种子确实携带TSWV，实现了TSWV的快速准确鉴定。

1 材料与方法

1.1 检测样品

检测样品为2018年7月自广州白云国际机场口岸进境的土耳其番茄种子，编号为1-4436751。

1.2 检测试剂

用于双抗体夹心-酶联免疫吸附试验（DASELISA）多克隆抗体及阳性对照样品购自美国Agdia公司，检测的病毒种类包括南芥菜花叶病毒（ArMV）、番茄斑萎病毒（TSWV）、番茄环斑病毒（ToRSV）、番茄黑环病毒（TBRV）。

柱式植物RNA提取试剂盒、RT-PCR两步法反应试剂盒、DNA Marker购自大连TaKaRa生物有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 样品制备

称取0.5 g番茄种子至研磨罐中，在研磨机上研磨1 min，将粉末转移至5 mL离心管中，加入3 mL样品提取缓冲液并混合均匀，然后10 000 r·min-1离心5 min，上清液用于DAS-ELISA检测。另取100 μL上述样品提取液，按照试剂盒说明书提取总RNA，用TSWV特异性引物进行扩增，用于RT-PCR检测。

1.4 DAS-ELISA检测

根据Agdia试剂说明书对番茄种子提取液进行DAS-ELISA检测。每个样品2次重复，取平均值。每孔加入检测样品提取液100 μL，并在阳性和阴性对照明显显色后（约30 min），在酶标仪中读取吸光值OD405。在满足质量控制要求下，如果样品OD405/阴性对照OD405≥2，判定为阳性，样品OD405/阴性对照OD405＜2，判定为阴性。

1.5 RT-PCR检测

TSWV特异性引物序列和扩增程序参照国家标准 GB/T 31802—2015，引物序列（5′-3′）为：F-AGGATTGGAGCCACTGAC，R-GCTGGAGCT GAGTATAGCAG，扩增序列片段长度为270 bp。检测时以含TSWV材料的cDNA作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。

cDNA合成：反应体系共20 μL，其中模板RNA 3 μL， 反 向 引 物（20 μmol·L-1）1 μL，5×MMLV 酶缓冲液 5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）2 μL，MMLV 反 转 录 酶（5 U·μL-1）1 μL，RNAase抑制剂1 μL，补无RNAase水至20 μL。然后37 ℃ 1 h，94 ℃ 10 min，自然冷却至室温，-20℃冰箱保存。

PCR扩增体系为25 μL，其中DNA模板2 μL， 上 /下 游 引 物（20 μmol·L-1）0.4 μL，10×PCR 缓 冲 液 2 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.5 μL，RNAase抑 制剂1 μL，补双蒸水至25 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。

PCR反应结束后取5 μL扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像仪上观测和拍照。

1.6 序列测定和分析

PCR产物回收后进行测序（华大基因技术有限公司）。用Blast进行序列分析，用于比较的GenBank中番茄斑萎病毒序列登录号为：JX452818、JX452817、KP006412、KP006413、JX452816。

2 结果与分析

2.1 DAS-ELISA检测

DAS-ELISA检测结果表明（表1），在检测样品中，TSWV检测项目的OD405/阴性对照OD405＞2，TSWV血清学检测结果呈阳性；其余检测项目中样品OD405/阴性对照OD405＜2，检测结果呈阴性。根据DAS-ELISA检测结果，初步判断该批番茄种子中携带TSWV。

表1 番茄斑萎病毒DAS-ELISA检测OD值

2.2 TSWV的RT-PCR检测与序列测定

2.2.1 RT-PCR检测 RT-PCR检测结果表明，检测样品扩增出1条与TSWV阳性对照大小一致的条带（270 bp左右），而阴性对照及空白对照没有扩增到该目标条带（图1）。因此，该检测样品TSWV的RT-PCR特异性检测结果呈阳性。

图1 番茄种子中TSWV特异引物的RT-PCR检测结果

2.2.2 序列测定与分析 PCR产物回收纯化后进行测序。结果表明，引物的扩增片段为270 bp，含有上下游引物的相应序列，与预期大小一致。序列Blast比对结果显示，与登录号为KP006413、JX452816的TSWV分离物序列相似度为99%，与登录号为JX452817、JX452818的TSWV分离物相似度达100%。结合DAS-ELISA检测结果，判断该批番茄种子中携带TSWV。

3 结论与讨论

TSWV寄主范围广泛，甚至能侵染一些田间杂草，从而使病源清除困难、传播速度快、防治困难。TSWV在世界范围内的发生与西花蓟马、棕榈蓟马等的广泛分布和携带病毒植物的调运有关（侯海霞 等，2015；卢小雨 等，2016）。其中西花蓟马是TSWV最高效的传播媒介，繁殖速度快、适宜性强、极易产生抗药性，防治难度较大。进境检验检疫数据表明TSWV多次在蓖麻、菜豆、生菜、莴苣、辣椒种子和马蹄莲种球、大丽花种球中被口岸截获。及时在口岸鉴定并销毁，是重要且有效防控TSWV的手段之一。

本试验直接采用研磨的种子进行检测，节省了种子育苗时间，缩短了检测周期和口岸货物通关周期。大量取样处理，在保证样品质量的前提下，样品更具有检测代表性。同时，由于DAS-ELISA可能会产生假阳性，采用了从血清学检测的样品提取液中提取总RNA进行RT-PCR扩增（廖富荣等，2011），保证了两种技术方法采用的为完全一致的样品，而且两种检测方法均为阳性检出，也与TSWV国家标准的判定一致。这是我国首次在进境番茄种子中截获TSWV，为进一步加强TSWV的检疫、防疫工作敲响了警钟，也对TSWV在种间传播的研究具有重要推动意义。