先天性中性粒细胞减少症研究进展

孟 新 侯 佳 张 萍 王晓川

1 先天性中性粒细胞减少症(CN)的定义与分类

中性粒细胞减少症是指外周血循环中性粒细胞绝对计数(ANC)减少，新生儿ANC<2.5×109·L-1，～12月龄婴儿ANC<2.0×109·L-1，>1岁的儿童或成人ANC<1.5×109·L-1 [1, 2]。根据病程分为急性和慢性中性粒细胞减少症。ANC<1.5×109·L-1，并且持续时间>3个月，可诊断为慢性中性粒细胞减少症。如ANC<0.5×109·L-1，并且持续时间>3个月，伴有高感染风险或潜在恶变倾向，可诊断为严重慢性中性粒细胞减少症。造成慢性中性粒细胞减少症的原因包括：骨髓中性粒细胞生成减少、外周中性粒细胞消耗增多(如感染或脾隔离)和中性粒细胞破坏增多(多由自身免疫引起)，其中骨髓中性粒细胞生成或释放减少的患者更易发生反复感染[3]。严重慢性中性粒细胞减少症包括重型先天性中性粒细胞减少症(SCN)、周期性中性粒细胞减少症(CyN)、免疫介导的中性粒细胞减少症和慢性特发性中性粒细胞减少症[3]。

CN是由先天性基因缺陷引起的以慢性中性粒细胞减少为特征的一组遗传异质性疾病。患者外周血循环ANC减少，可呈持续性、间歇性或周期性。根据ANC减少程度，分为重度、中度和轻度(ANC分别为<0.5×109·L-1、～1.0×109·L-1和～1.5×109·L-1)。除血液系统外，还可累及其他系统，包括中枢神经系统、心脏、胰腺、皮肤和肌肉等。与急性中性粒细胞减少症相比，除ANC偏低以外，SCN具有早发的反复感染、骨髓粒细胞成熟障碍等特征[1]。

SCN是一类罕见的血液系统生成障碍性疾病，发病率约为1/200 000[4]，多种基因突变均可以导致SCN，患者骨髓早/中幼粒细胞成熟障碍，细菌感染发生较早，感染风险较高，部分病例容易演变为急性髓细胞白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)[5, 6]。ELANE、Gfi-1、HAX1、G6PC3、VPS45、JAGN1、CSF3R等多种基因突变均可引起SCN，其中ELANE基因突变最常见，占60%左右[7]。ELANE基因突变还可引起CyN，患者外周血ANC呈周期性变化，一般为21 d，ANC低谷期持续4～6 d，ANC最低可检测不到[3, 8, 9]。

2 髓系发育及转录调控

如图1所示，造血干细胞(HSC)经过多能祖细胞(MPP)、共同髓系祖细胞(CMP)、粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)、原始粒细胞(Myeloblast)、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞，最终发育为成熟的杆状核粒细胞及分叶核粒细胞。从中幼粒细胞阶段开始，根据粒细胞胞浆内产生的特殊颗粒不同，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。粒细胞分化发育过程可以分成早期和晚期两个阶段。早期阶段从原始粒细胞开始，细胞增殖活跃；初级颗粒产生后进入早幼粒细胞阶段；中幼粒细胞阶段二级颗粒及特殊颗粒生成，细胞停止分裂。晚期阶段，晚幼粒细胞、杆状核粒细胞和分叶核粒细胞内三级颗粒生成，细胞核型明显改变。对原始粒细胞进行体外培养能够产生粒细胞/单核细胞/粒细胞单核细胞集落形成单位(CFU-G/CFU-M/CFU-GM)，分别由粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞-集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞单核细胞-集落刺激因子(GM-CSF)诱导，说明粒细胞系和单核细胞系具有高度同源性，也解释了为何CN患者总伴随单核细胞异常。骨髓细胞的谱系形成与分化过程受到严格调控，细胞因子和转录因子是决定髓系分化成熟的关键[10, 11]。

调控髓系基因表达的转录因子在粒细胞分化早期主要为C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein α)、PU.1、CBF(core binding factors)、c-Myb，晚期主要为C/EBPε、PU.1、 CDP(CCAAT displacement protein)、Gfi-1。早期阶段C/EBPα∶PU.1比值决定了共同CMP分化的方向，比值升高促使CMP向粒细胞系分化，反之则向单核细胞分化[12, 13]。不同阶段表达的不同转录因子能够促进粒细胞内相应颗粒的产生(图1B)[14]。此外,需要注意的是，应激状态下的中性粒细胞生成主要受C/EBPβ和STAT5的调控。

与转录因子对髓细胞分化命运确定性的调控不同，细胞因子的调控更像随机产生的。不同造血细胞因子构成的微环境促使骨髓细胞向着不同方向分化，其中G-CSF、GM-CSF和IL-3是调控髓系分化发育最重要的细胞因子(图1A)[15]。

图1骨髓中性粒细胞分化发育及其调控图

注 A：骨髓细胞分化图，骨髓细胞在不同造血细胞因子和转录因子调控下向不同方向分化；B：中性粒细胞发育图

G-CSF通过与其受体(G-CSFR)结合激活一系列信号通路，包括JAK/STAT、Ras/MAPK、PI3K-PKB/Akt和MYC(c-Myc)通路(图2)[16]。G-CSFR是一种含有813个氨基酸的膜蛋白，其胞浆区部分含有188个氨基酸，近细胞膜端有2个保守序列(Box1和Box2)，与有丝分裂相关，细胞膜远端有一个保守性低的Box3序列，主要负责传递信号。此外，它还有4个酪氨酸(Y)残基，当G-CSF与G-CSFR结合后这些酪氨酸残基会快速磷酸化，激活下游的信号分子。研究发现，不同的信号通路是由不同的酪氨酸残基激活的，如Y704、Y744和Y729可以激活Stat3，Y704和Y764可以激活SHP2/Grb2。Y764对Grb/p90复合体的形成和p21的激活也必不可少。在G-CSFR第650位色氨酸(W650)影响下，Jak2和/或其他Jak激酶可以与Box1和Box2中间部分结合，激活Stat1、Stat5和c-Rel。

图2G-CSFR信号通路图[3]

注 G-CSF通过与G-CSFR结合激活下游多条信号通路，包括JAK/STAT、 Ras/MAPK、PI3K-PKB/Akt等

G-CSFR还可以激活Src激酶(Lyn和Hck)、Syk激酶、3’-磷酸肌醇激酶(PI3K)，PI3K进一步激活PKB/Akt通路[16]。SHIP蛋白可以水解PI3K。SHIP蛋白缺陷小鼠的PKB/Akt激酶活性增加，表现出骨髓细胞病态增生，脾肿大、淋巴结病和重要器官骨髓细胞浸润[17]。

研究表明，CN患者的G-CSFR通路下游受损或异常活化，如HCLS1蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)表达和功能降低，其中髓系特异性转录因子LEF-1低表达导致PU.1的表达升高，加之C/EBPα本身表达降低，从而导致C/EBPα∶PU.1比例降低，CMP向单核细胞系分化增多而向粒细胞系分化减少。此外，NAMPT/NAD(+)/SIRT通路调节的代偿性升高可持续激活应激状态下的中性粒细胞生成[18]。CN患者骨髓细胞学染色常表现出早幼粒细胞成熟障碍，粒系细胞计数原始粒细胞和早幼粒细胞数目增多，而中性中幼粒细胞、中性晚幼粒细胞、中性杆状核粒细胞及中性分叶核粒细胞数目很少甚至缺如。

3 CN的致病基因和临床特征

CN目前还没有统一的分类标准，根据有无血液系统外症状分为症候群性CN和非症候群性CN两大类。本文参考Donadieu等的相关综述文章[19](检索NCBI数据库，检索至2017年3月)，对迄今为止发现的24个CN相关的致病基因进行了总结(表1)。

3.1ELANE基因突变导致SCN1和CyNELANE基因突变最早发现于CyN患者，之后在SCN患者中也有报道[9, 20]。呈常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或散发性，以点突变居多，目前已发现超过100个突变位点，散布于组成该基因的5个外显子区域，此外还有插入突变、移码突变、无义突变、剪切位点突变、转录起始位点变异以及5'端增强子区域变异[21, 22]。ELANE基因编码中性粒细胞内一种丝氨酸蛋白酶即NE，NE贮存于中性粒细胞溶酶体内，能水解细胞外基质和细菌，是中性粒细胞发挥固有免疫功能的重要武器[23]。

NE作用强大而广泛，但NE生成过多时是有害的，NE是慢性阻塞性肺病病理过程的关键分子[24]。转录水平上，ELANE基因mRNA仅在骨髓早幼粒细胞内高表达，此阶段为中性粒细胞内特殊颗粒生成旺盛阶段，随后表达量逐渐降低，外周血中成熟中性粒细胞阶段ELANE的mRNA表达极低甚至测不出，NE转录生成的严格调控保证了机体的稳态[25]。

ELANE突变导致CN的分子机制还未定论，目前有三个假说。一是错误定位假说，认为AP3能够运载NE穿越高尔基体到达嗜天青颗粒(中性粒细胞内主要颗粒)，NE的C-末端断裂突变导致该功能受损，突变后的NE聚集在错误的亚细胞结构区，堆积的蛋白产生细胞毒性从而导致细胞凋亡[26]。二是未折叠蛋白反应(UPR)假说，解释了中性粒细胞成熟障碍的问题，认为ELANE基因突变导致NE蛋白生成过程中产生折叠错误。HSPA5(heat shock 70-kDa protein 5)和XBP1(X-box-binding protein 1)两种应激标志物的mRNA升高，从而推测突变后的NE引发了内质网应激反应(ERS)。细胞培养和转基因小鼠模型表明ERS导致中性粒细胞的自噬和凋亡[27, 28]。三是抑制假说，主要解释了CyN的发病机制，认为ELANE突变在中性粒细胞生成调控过程中产生了负反馈，从而对中性粒细胞增殖分化产生周期性损伤，运用数学模型阐述了CyN 21 d的周期性，另有实验通过NE蛋白与其转录抑制因子Gfi-1进行酵母双杂交实验发现，PFAAP5蛋白能够与NE相互作用，干扰Gfi-1的转录调节，从而为该假说提供了依据[29]。

3.2Gfi-1基因突变导致SCN2Gfi-1基因突变导致的SCN又称为SCN2，为常染色体显性遗传，发病率<1/2.2×106，表现为骨髓早/中幼粒细胞成熟障碍伴单核细胞增多。Gfi-1锌指转录抑制因子癌蛋白家族由Gfi-1和Gfi-1B组成，该家族成员具有能与DNA结合的锌指结构域，通过启动一系列基因转录在造血过程中发挥广泛且重要的调控作用。在髓系细胞方面，Gfi-1不仅能够抑制髓系祖细胞增殖，还决定髓系祖细胞向粒系或单核巨噬细胞系分化。作为粒系特异性ELANE、C/EBPα基因的转录抑制因子，Gfi-1间接促进了单核细胞的生成，而其与CXCR4基因相互作用则促进中性粒细胞释放入外周血循环。此外，Gfi-1在淋巴系细胞分化发育增殖等方面也发挥重要的调节作用，但是Gfi-1基因突变对淋巴系细胞影响很小。缺乏Gfi-1的小鼠中性粒细胞分化障碍并且T淋巴细胞分化也部分被阻断。红系和巨核系则主要受Gfi-1B调控，干扰Gfi-1B会阻断红细胞生成，导致胚胎期死亡[30, 31]。

HAX1(HCLS1相关蛋白X-1)是细胞内一种泛表达的多功能蛋白，主要定位于线粒体，也存在于内质网和核内，与信号转导和控制细胞骨架相关[36]。HAX1最初被认为是HCLS1(HCLS1)的结合蛋白。HCLS1是BCR信号通路上的一种蛋白激酶， 与B细胞分化发育有关，其表达过高会导致淋巴细胞白血病，而其增强子区域又能与粒细胞特异性转录因子C/EBPα和 C/EBPβ结合。Skokowa等[37]发现，粒细胞受G-CSF刺激后HCLS1发生磷酸化，磷酸化的HCLS1与LEF-1(lymphoid-enhancer binding factor 1)结合，并运载LEF-1进入细胞核，LEF-1能够激活C/EBPα，与粒细胞分化息息相关，HAX1基因突变患者中也可观察到HCLS1磷酸化受阻，从而解释了HAX1作为泛表达基因，其基因突变却可能仅仅导致粒细胞减少症状。从HAX1自身角度出发，HAX1能维持线粒体膜电位，阻止髓细胞凋亡，故目前认为HAX1突变的SCN患者中性粒细胞减少的原因主要是HAX1的抗凋亡功能受损，异位表达HAX1确实可以纠正中性粒细胞凋亡[37]。最近在心肌缺血再灌注损伤患者中发现，HAX1通过与Hsp90和IRE-1信号抑制剂相互作用，降低了内质网应激反应(ERS)[38]。可能解释了ELANE-SCN和HAX1-SCN的重叠表型患者症状更轻的现象。

3.4G6PC3基因突变导致SCN4和SLC37A4突变导致糖原累积症(GSD)1b型(GSD1b) 糖原在肝内分解成6-磷酸葡萄糖，经葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)催化脱磷酸基成为葡萄糖，为组织细胞提供能量。G6P是一种定位于内质网膜上由3种蛋白酶组成的复合酶体，其中转移酶(SLC37A4，G6PT1)和催化酶异常都能引起CN。催化酶由G6PC1、G6PC2和G6PC3组成的基因家族编码，在不同组织中3个基因表达不同，G6PC1主要在肝脏、肾脏和小肠中表达；G6PC2主要在胰腺中表达；G6PC3广泛表达于全身。G6PC1基因突变导致GSD1a，SLC37A4基因突变导致GSD1b，G6PC3基因突变导致SCN4[1, 39]。

G6PC3基因突变至今已经报道60多例，为常染色体隐性遗传，又称SCN4。G6PC3突变导致酶活性降低或酶稳定性降低，引起内质网应激反应，导致细胞凋亡和中性粒细胞活性异常。患者除了CN和反复细菌感染之外，还常有间歇性血小板减少、皮肤浅表静脉凸出、先天性心脏病及泌尿系统异常表现。SCN4临床表型复杂多样，可有一些罕见症状，如骨髓谱系成熟停滞、无效生成性慢性粒细胞缺乏症、胸腺发育不良、炎症性肠病、原发性肺动脉高压、内分泌异常、生长迟缓、轻微面部畸形、骨骼和体表异常等等，也可仅表现为SCN[39]。

GSD1b型是一种由SLC37A4基因突变导致的遗传代谢性疾病，临床表现除与GSD1a型类似的肝肿大、发育异常、空腹低血糖和血脂异常外，还表现出中性粒细胞减少症和/或中性粒细胞功能障碍，口腔炎、炎症性肠病的发生风险较高[40]。GSD1b区别于其他类型CN的是，GSD1b患者还存在中性粒细胞功能障碍，包括细胞趋化活性、吞噬能力和呼吸爆发功能降低，而中性粒细胞功能、数量的异常可能与外周血中性粒细胞过度凋亡有关，而非中性粒细胞成熟障碍[41, 42]。

3.5VPS45突变导致SCN5 囊泡介导的蛋白分选是将细胞内分子分配到不同细胞器的过程，酵母实验发现超过40种蛋白分选蛋白与囊泡运输有关，VPS45基因编码的Vps45蛋白就是其中之一，能够将蛋白从高尔基体转运至反面高尔基网。VPS45基因突变导致常染色体隐性遗传的SCN5，2013年相继2篇文献报道了VPS45基因突变患者会表现出中性粒细胞减少、中性粒细胞功能异常、骨髓纤维化、血小板无力症和肾肥大等症状，且对G-CSF治疗无反应。患者Vps45及其相关蛋白表达降低，细胞内膜运输系统发生异常，VPS45缺陷的中性粒细胞整合素β表达降低，外周血中性粒细胞和骨髓细胞可观察到加速凋亡现象[43, 44]。还有病例报道VPS45基因突变可能导致神经系统损伤[45]。

3.6JAGN1基因突变导致SCN6JAGN1编码的Jagunal同源蛋白1参与早期分泌途径，是G-CSFR信号通路不可或缺的组成部分，对中性粒细胞的分化和存活至关重要。2014年Boztug等[46]发现9例JAGN1基因纯合突变的SCN患者，中性粒细胞表现出超微结构缺陷、颗粒减少、多种蛋白氨基端糖基化和凋亡率增加。同期的小鼠实验也证实JAGN1基因缺陷使中性粒细胞的固有免疫功能受损，不能有效抵御真菌感染，但是中性粒细胞数量并没有减少。此外，GM-CSF可以改善JAGN1突变的人骨髓细胞抗真菌活性，为SCN患者治疗提供了新思路[47]。

3.7CSF3R基因突变导致SCN7 CSF3R是G-CSF的受体，其胞外区含有免疫球蛋白样结构域、细胞因子受体同源结构域和3个纤连蛋白结构域，其胞内结构域可以活化Janus激酶，激活转录因子STAT3和STAT5、Ras/MAPK、PI3K-Akt通路[48]。之前发现的SCN患者体细胞或者减数分裂期细胞CSF3R杂合突变通常导致CSF3R胞内区截短变异，与突变细胞过度增殖及SCN患者白血病转归有关[49]。2014年发现2个家系CSF3R基因功能缺失突变表现为常染色体隐性遗传的SCN，其骨髓细胞无成熟障碍，对G-CSF治疗无反应[50]。

3.8WASP基因突变导致XLNWAS基因编码WAS蛋白(WASp)，WAS基因突变对WASp水平影响程度不同，WASp表达水平与疾病的严重程度相关，WAS基因突变导致的WASp功能丧失会引起Wiskott-Aldrich综合征(WAS)，而突变导致的WASp功能增强则会引发X连锁中性粒细胞减少症(XLN)，此外，X连锁血小板减少症也可由WAS基因突变引起。WAS是一种罕见的X连锁原发性免疫缺陷病，其特征为血小板减少伴体积缩小、湿疹、反复感染并且自身免疫性疾病和淋巴瘤的发生率增加[51, 52]。

XLN主要特点为外周血中性粒细胞减少，容易发生细菌感染，可伴有骨髓发育不良和其他血细胞减少。生理状态下，WASp的VCA结构域与GTP酶结合结构域(GBD)的疏水区结合使得WASp在胞浆内处于自身抑制状态，难以与ARP2-ARP3复合物结合来帮助肌动蛋白组成肌丝。编码VCA结构域的WAS基因突变会干扰自身负反馈抑制，导致WASp持续高表达，引起中性粒细胞、单核细胞、NK细胞等多种血细胞减少和骨髓发育不良。XLN比WAS更为罕见，目前只有少数几个病例报道了4种突变位点(Leu270Pro、Ser270Pro、Ile276Ser 和 Ile294Thr)，且临床表型差异较大，其中除Ile294Thr突变位点位于GBD的疏水口袋外，其余突变位点均位于VCA结构域[53, 54]。

3.9 近5年新发现的致病基因 随着二代测序技术和生物信息学领域的快速发展，不断有新的致病基因被发现，迄今为止已经报道了24种CN相关致病基因(见表1)。近5年新发现的基因包括CSF3R(2014年)[50]、CXCR2(2014年)[55]、JAGN1(2014年)[46]、TCIRG1(2014年)[4]、GATA2(2015年)[56]、CLPB(2015年)[57]、EFL1(2017年)[58]、SMARCD2(2017年)[59]。CXCR2是CXCL12的受体，CXCR2突变后成熟中性粒细胞不能正常释放进入外周血中，导致无效生成性慢性中性粒细胞减少症[55]。TCIRG1(T Cell Immune Regulator 1)编码V-ATP酶的1个亚基，能调节细胞内pH水平，其突变可导致常染色体显性遗传的SCN[4]。GATA2是一种锌指转录因子，对胚胎期造血和淋巴管生成至关重要，其突变可以导致多种临床表型，对分枝杆菌、病毒和真菌易感，CN和/或再生障碍性贫血患者中的突变率达10%，其致病性突变多在内含子调节区域和外显子5’端[56]。CLBP编码酪蛋白水解肽酶B同源体，属AAA+蛋白家族成员，其突变导致CN、智力低下、渐进性脑萎缩、运动障碍、白内障和3-甲基戊二酸尿症[57]。EFL1与SBDS基因类似，都编码核糖体蛋白，调控RNA表达，表现为Shwachman-Diamond综合征2型[58]。SMARCD2编码 SWI/SNF蛋白家族成员，通过对染色体进行重塑参与特定基因的转录，如CEBPε转录，SMARCD2突变患者中性粒细胞内无特殊颗粒[59]。

近期有学者提出用临床症状评分的方法来初步鉴别CN与普通的慢性粒细胞减少症[60]，以此为基础建立CN相关基因筛查方案，以提高CN的临床检出率，而通过全外显子/宏基因组测序则可能发现更多的CN致病基因。

3.10 良性中性粒细胞减少 临床还发现一类特殊的CN，程度较轻，ANC(0.5～1.5)×109·L-1,不会引起骨髓细胞学改变，也没有细菌或真菌感染的风险，具有明显的种族相关性，在美国黑人群体占4.5%，白人群体占0.8%，DARC基因多态性可引起该现象[61]。

4 治疗和转归

4.1 G-CSF 几乎所有的SCN和CyN患者确诊后均会使用G-CSF，用于提高和维持ANC>1.0×109·L-1。自1987年G-CSF用于治疗CN后，患者预后和生存质量得到极大改善。最初接受G-CSF治疗的患者，ANC中位数从0.129×109·L-1升高至2.125×109·L-1。G-CSF剂量在1～120 μg·kg-1·d-1可升高和维持ANC在1.0 × 109·L-1水平，绝大多数患者在25 μg·kg-1·d-1以下即有效[62-65]。一般CyN患者G-CSF起始剂量为1～3 μg·kg-1·d-1，SCN患者起始剂量为5 μg·kg-1·d-1，每日皮下注射，10～14 d内逐渐提高剂量直至ANC> 1.0 × 109·L-1。G-CSF常见不良反应包括骨痛、头痛、肌痛等，按推荐剂量使用一般可以避免[66]。当G-CSF剂量超过50 μg·kg-1·d-1，而ANC仍<0.5 × 109·L-1时，则认为患者对G-CSF无反应，也有专家认为G-CSF剂量达25 μg·kg-1·d-1就可以判定患者无反应或者反应差(www.depts.washington.edu/registry/ www.scnir.org)。使用G-CSF虽然能提高ANC数量，但部分患者仍会有感染症状，如口腔炎、牙龈炎等，需要联合抗生素治疗，并坚持日常口腔护理。G-CSF在提高外周血中性粒细胞数量同时也带来了一定风险。据统计，使用G-CSF会增加平均每年2.3%的AML转化风险[67]。国际重症慢性中性粒细胞减少症登记处(SCNIR)、法国重症慢性中性粒细胞减少症登记处(SCNFR)和瑞典群体的报告，启动G-CSF 治疗15 年后，SCN患者发生MDS/AML 累计发病率分别为22%、8.1% 和31%[68]。对G-CSF无反应患者和转化为MDS/AML患者，造血干细胞移植(HSCT)是目前唯一的治疗途径[69]。

4.2 HSCT HSCT适用于对G-CSF无反应和易转化为MDS/AML的CN患者，但是何时为干细胞移植的最佳时机还未有定论。无恶变的患者移植后效果理想，无病生存率可达75%，移植成功的CN患者外周血中性粒细胞数量可以恢复正常，而不需要使用G-CSF。但是HSCT治疗的风险较高，因此对G-CSF无反应患者推荐HSCT治疗时需谨慎，而转化为AML/MDS的患者，如若不进行HSCT治疗，其生存率将大幅降低。自2001年对CN患者HSCT治疗的化疗方案、手术时机和术前准备进行相关调整后，患者手术后生存率极大提高，SCNIR欧洲登记处报道患者的5年生存率达到80%[70]。

此外，有研究报道，NE抑制剂(西维来司他)能够使ELANE基因突变患者来源的iPS细胞克服早幼粒细胞成熟障碍而分化为成熟中性粒细胞[71, 72]，而维生素B3则可以通过激活NAMPT/SIRT通路促进应激状态下的骨髓中性粒细胞生成[73]，为CN患者的临床治疗提供了新思路。