miR-98通过调控ox-LDL诱导血管内皮损伤抑制动脉粥样硬化形成的作用机制研究

刘继红，冯斌

动脉粥样硬化（AS）引起的慢性炎症反应是冠心病、脑卒中、心力衰竭等心脑血管疾病的主要病理基础，如何有效防治AS的发生和发展，是全球医学界长期关注并亟待解决的重大难题[1]。AS的发病机制与多种调控因子和病理过程密切相关，包括内皮损伤、脂质浸润、氧化应激等[2]。微小核糖核酸（miR-98）是一类生物作用巨大的、非编码的小RNA，参与了大量基因或信号通路的调控作用，在心血管疾病发生过程中发挥着重要生物学效应[3]。其中miRNA-98是发现较早的一类miRNA，属于let-7家族成员，高表达于多种肿瘤细胞，通过作用于多种抑癌因子，参与肿瘤细胞的增殖、浸润和凋亡等过程[4]。但是目前关于miR-98与AS发病机制的研究探讨尚少。血管内皮损伤学说认为，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是引起血管内皮损伤的主要参与因子，在凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）的作用下，低密度脂蛋白被修饰成为ox-LDL，刺激单核细胞转化并形成巨噬细胞源性泡沫细胞，最终导致脂质斑块的形成[5]。因此通过抑制LOX-1的表达，降低ox-LDL引发的血管内皮损伤，可能为临床治疗AS的药物研发提供新的潜在靶点。有研究通过生物信息学预测系统，认为miR-98可与LOX-13’UTR区域结合，抑制LOX-1的表达[6]。本项研究通过探讨miR-98血管内皮损伤中的调控作用以及可能的作用机制，为AS分子治疗提供新的靶点和选择。现研究报告如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料来源

1.1.1 受试细胞人主动脉内皮细胞（HAEC）和人主动脉平滑肌细胞（HASMC）来源于American Type Culture Collection（ATCC）细胞库。

1.1.2 受试动物野生型C57BL/6小鼠8只，清洁级，4～6周龄，22～25g，由北京维通利华实验动物中心提供，饲养于本单位SPF级动物房内。

1.1.3 实验对象及分组选取2017年3月～2017年10月于山东省医学科学院附属医院心血管内科就诊的AS患者60例，其中男性37例，女性23例，年龄48～82（64.08±10.24）岁；另外选择同一时期在我院体检中心进行健康体检的正常受试者20例作为健康对照组，其中男性10例，女性10例，年龄，年龄45～80（62.55±10.87）岁。

1.2 主要试剂ox-LDL（TBARs 90 nmol MDA/mg），Alfar Aesar公司；miR-98模拟物和抑制物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自中国博士德生物工程有限公司；cDNA合成试剂盒、real-time PCR试剂盒、细胞凋亡试剂盒，购自美国OMEGA生物公司；细胞核因子κB （NF-κB p16）抗体和内皮素-1（ET-1）抗体，购自美国Abcam公司；LOX-1单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司；β-actin多克隆抗体购自中国博士德生物工程有限公司；脂质体Lipofectamine 2000、Opti-MEM培养基、血管细胞培养基，购自美国Invitrogen公司；DMEM高糖细胞培养基，购自美国GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA细胞消化液（0.25%），购自北京钮因华信科技发展有限公司；FBS胎牛血清和链霉素-青霉素双抗，购自美国Thermo Fisher公司；Trizol，购自美国Invitrogen公司；DEPC，购自美国Sigma公司；30% H2O2，购自上海碧云天生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液、氯仿、异丙醇、无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器GTR16-2型高速台式冷冻离心机，北京时代北利离心机有限公司；5810R型台式冷冻离心机，德国Eppendorf；JB-CJ-1500FX超净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；实时定量PCR仪，美国MJ Research公司；UV-8000紫外分光光度计，上海精密仪器仪表公司；iMake多功能酶标仪，日本Bio-Rad公司；CX41倒置光学显微镜和OLS4100激光共聚焦显微镜，日本奥林巴斯；电子分析天平，上海玉研科学仪器有限公司；Amersham电泳仪，瑞典Bioscience；恒温水浴摇床和YCZ-40D型转移电泳槽，北京六一仪器厂；FluorChem FC3凝胶成像数码分析系统，美国ProteinSimple。

1.4 血液样本采集采集所有受试者空腹血液样本5 ml，置于血液采集管中，室温静置1 h后，低速离心，加入50 ml 0.1%无菌焦炭酸二乙酯溶液，混匀后，置于4℃保存备用。

1.5 血清LOX-1含量测定采用酶联免疫吸附测定（ELISA）测定外周血LOX-1含量，按照LOX-1 ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.6 细胞培养将HAEC细胞或HAMSC细胞培养在含有10%FBS的血管细胞培养基中，将细胞置于37℃，5%CO2细胞培养箱中进行培养。24～48 h更换培养液，48 h传代一次。

1.7 提取小鼠腹腔巨噬细胞向5只野生型C57BL/6小鼠腹腔注射3 ml 3%巯基乙醇酸钠，3 d后颈椎脱臼将小鼠处死，向小鼠腹腔中注射5 ml预冷的无菌PBS缓冲液，5 min后采用无菌注射器将腹腔液抽出，放置5 ml无菌离心管中，低速离心，弃上清，加入DMEM培养液重悬，再次离心，弃上清，加入含有10%FBS的DMEM培养液，重悬细胞，将细胞和培养液移至培养瓶中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中进行培养24～48 h。待细胞贴壁后，更换培养液，保存备用。

1.8 MTT法检测ox-LDL对HAMSC细胞、HAEC细胞和巨噬细胞增殖的影响将HAEC细胞或巨噬细胞（1×103个/孔）单层接种到96孔板中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中进行培养，每组设置8个平行孔，每组分别加入不同终浓度的ox-LDL（0、5、15、45、135 μg/ml），继续培养48 h，每孔加入20 μl MTT，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育4 h后，弃除上清液，每孔加入200 μl DMSO，置于振动器上震动5 min，置于显微镜下观察无紫色结晶物。将96孔板放置于450酶标仪上，检测波长为570 nm，参比波长为450 nm处的吸光光度值（OD值），计算平均值。

1.9 ox-LDL干预实验将HAEC细胞、HASMC细胞或巨噬细胞（5×105个/孔）分别单层接种到6孔板中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中进行培养，24 h后，每组分别加入不同终浓度的ox-LDL，继续培养48 h，收集细胞，分别提取RNA或蛋白，备用。

1.10 细胞转染提前1 d在相应备行转染的6孔板上接种5×105个细胞，培养24 h后，融合率达到50%～60%，在不同2 ml无菌EP管中分别加入适量生理盐水，然后按照脂质体转染说明书，在EP管中分别加入5 μl miR-98模拟物或抑制物250μl无血清Opti-MEM培养基，混匀，室温放置10 min；另外在5 μl脂质体Lipofectamine 2000溶液中加入250 μl无血清Opti-MEM培养液，振荡混匀后，室温放置10 min；将上述两种溶液吹打混匀，室温放置30 min；将脂质体-质粒DNA复合液滴加至孔板细胞表面，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24～48 h。提取细胞RNA及蛋白，验证目的基因表达情况及转染效率。

1.11 RT-PCR方法检测miR-98、LOX-1、NF-κB p65、ET-1基因的表达①提取总RNA：收集细胞1×1010个，置于EP管中；加入1 ml预冷的Trizol，充分混合均匀，静置5～10 min；加入200μl氯仿，震荡30 s，静置5～10 min；12 000 rpm离心，取上清；加入500 μl异丙醇，震荡30 s，静置5～10 min；12 000 rpm离心，弃上清；加入1 ml 75%乙醇，震荡30 s，12000 rpm离心，弃上清；将EP管倒置于滤纸上，将RNA充分干燥；加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分装，置于-80℃保存备用。采用凝胶电泳检测RNA分子量；采用分光光度计检测RNA浓度。②RNA反转录：根据试剂盒说明书操作进行。将cDNA保存至-20℃保存备用。③实时定量PCR：将20 μl反应体系置于37℃恒温水浴60 min，85℃ 5 s，加入去离子水至100 μl，各反应孔取2 μl进行PCR。冰浴中配制20 μlPCR反应体系，95℃30s预变性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循环45次。引物序列如下：miR-98（上游引物：5’-TTTTGTTTTTGCTGGTCTTAG-3’；下游引物：5’-AGCAGACAGTCAGGCAGGAT-3’）；NF-κB p65（上游引物：5’-TGACTGGATTCG CTAGGTAGAAG-3’；下游引物：5’-GGCAA TTTTCAGAGCTATTAG-3’）；ET-1（上游引物：5’-GCTTAGGGGCTAATCGGACT -3’；下游引物：5’- CGAAACCTACTGATGGCCCTAG-3’）β-actin（上游引物：5’-CAGCTTT GAGGTTCGTGTTTGT-3’；下游引物：5’-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA -3’）。

1.12 Western blot方法检测miR-98、LOX-1、NF-κB p65、ET-1蛋白的表达①提取蛋白样品；②蛋白样品凝胶电泳；③转膜；④封闭；⑤加入一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦显影；⑧采用化学发光法检测膜上的蛋白表达条带，采用FluorChem FC3凝胶成像数码分析系统进行定量分析，以积分光密度（IOD）表示灰度值。

1.13 统计学处理本资料采用SPSS 19.0统计学软件进行处理；计量资料采用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK检验；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者血浆中miR-98和LOX-1水平比较经RT-PCR检测结果显示，AS组患者miR-98表达水平明显低于健康受试者；经ELISA检测结果显示，AS组患者LOX-1表达水平明显高于健康受试者。差异均具有统计学意义（P均＜0.05）（图1～2）。

2.2 ox-LDL对HASMC细胞、HAEC细胞、巨噬细胞增殖活性的影响加入不同浓度ox-LDL分别干预48 h后，经MTT检测结果显示，在ox-LDL 15μg/ml干预下，HAEC细胞和小鼠巨噬细胞增殖抑制作用最强，与空白对照组相比，有统计学差异（P＜0.05）。ox-LDL干预对HASMC细胞几乎无影响，HAMSC细胞一直正常生长（表1）。

图1 健康受试者和AS患者血浆miR-98表达量比较（与健康受试者比较，aP＜0.05）

图2 健康受试者和AS患者血浆LOX-1水平比较（与健康受试者比较，bP＜0.05）

2.3 HASMC细胞、HAEC细胞、巨噬细胞miR-98表达情况经RT-PCR检测结果显示，在对照组中（0 μg/ml ox-LDL干预）HAEC和巨噬细胞中miR-98表达量明显高于HASMC细胞，有统计学差异（P＜0.05）；且经15 μg/ml ox-LDL干预后，HAEC和巨噬细胞中miR-98表达量明显降低，与干预前比较有统计学差异（P＜0.05）（图3）。

2.4 miR-98模拟物和抑制物对LOX-1表达的影响经RT-PCR和Western blot检测结果显示，miR-98可明显抑制HAEC细胞和巨噬细胞LOX-1 mRNA和蛋白的表达，与空白质粒对照组比较，具有统计学差异（P＜0.05）（表2）。

2.5 miR-98模拟物和抑制物对NF-κB p65表达的影响经RT-PCR检测结果显示，miR-98模拟物转染和抑制物转染对NF-κB p65 mRNA的表达影响不明显，与空白对照组相比，无统计学差异（P＞0.05）；但是经Western blot检测结果显示，miR-98模拟物转染可明显抑制HAEC细胞和巨噬细胞NF-κB p65蛋白的表达，而miR-98抑制物转染可上调NF-κB p65蛋白的表达，与空白质粒对照组比较，具有统计学差异（P＜0.05）（表3）。

2.6 miR-98模拟物和抑制物对ET-1表达的影响经RT-PCR和Western blot检测结果显示，miR-98模拟物转染可明显抑制HAEC细胞和巨噬细胞ET-1mRNA和蛋白的表达，而miR-98抑制物转染可上调ET-1 mRNA和蛋白的表达，与空白质粒对照组比较，具有统计学差异（P＜0.05）（表4）。

图3 HASMC细胞、HAEC细胞、巨噬细胞miR-98表达量比较（与HASMC细胞组比较，aP＜0.05；与HAEC细胞组比较，bP＜0.05；与ox-LDL（0 μg/ ml）比较，cP＜0.05）

表3 miR-98模拟物和抑制物对HAEC细胞和巨噬细胞NF-κB p65表达的影响

表4 miR-98模拟物和抑制物对HAEC细胞和巨噬细胞ET-1表达的影响

3 讨论

我国是动脉粥样硬化的高发地区，由AS引发的心脑血管疾病致死率是最重要的死亡原因之一。虽然AS的发病机制尚未研究清楚，但是“内皮损伤-反应”学说是目前公认的AS形成机制[7]。关于AS的治疗一直是全球医学界亟待攻克的难题。近年来MicroRNAs的研究为AS的治疗提供了新的思路[8]。miRNAs作为内源性非编码小分子RNA，可通过结合靶mRNA的3’端非编码区，编码区或5’非编码区，在转录后水平调节多种基因的表达，抑制或降解靶mRNA的翻译，参与细胞凋亡、增殖、分化等多种病理生理过程[9]。研究显示，至少有一半以上的miRNA基因位于炎性反应相关的基因组区域或者脆性位点，发挥促进或抑制炎症反应的作用[10]，其中miR-98是早期发现的一类具有癌基因活性的小RNA，在很多恶性肿瘤细胞中呈高表达[11]，但是目前关于miR-98与血管内皮损伤的关系研究尚少。本项研究在前期生物信息学预测结果的基础上，进一步探讨miR-98对血管内皮细胞损伤的调控机制。

ox-LDL作为参与动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤的主要损伤因素之一，通过与清道夫受体结合，刺激单核细胞迁移并转化成巨噬细胞，进一步形成巨噬细胞源性泡沫细胞，同时ox-LDL可促使泡沫细胞坏死形成AS条纹或斑块，造成血管腔狭窄或阻塞[12]。因此干扰ox-LDL的表达是防治AS发生、发展的重要措施。LDX-1是位于血管内皮细胞、平滑细细胞表面的主要清道夫受体之一，与LDL氧化密切相关[13,14]。有研究认为[15]，LOX-1上调可能是AS发生的启动因素，因此miR-98对LOX-1受体和ox-LDL的调控作用是笔者本项研究的重点，目前国内关于这方面的研究还处于起步阶段。笔者首先探讨了AS患者血浆中miR-98和LOX-1的表达情况，结果显示，AS组患者miR-98表达明显下调，而LOX-1表达却出现明显上调。提示miR-98与LOX-1的表达可能呈负相关性，同时也肯定了miR-98可能参与了AS的发生、发展过程。LOX-1是ox-LDL特异性结合受体，笔者通过采用ox-LDL干预对HMASC、HAMSC、HAEC和小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响，结果显示，ox-LDL在15 μg/ml时对miR-98的抑制作用最强。

在上述实验结果的基础上，笔者进一步探讨了miR-98对NF-κB信号通路的影响。ox-LDL通过刺激内皮细胞线粒体内活性氧自由基的表达，从而激活NF-κB信号通路以及下游调控因子，如内皮素-1（ET-1）的表达[16]。本项研究中，我们通过构建miR-98模拟物和抑制物转染细胞株，并检测经ox-LDL干预后细胞NF-κB p65和ET-1的表达情况。结果显示miR-98可明显改善内皮细胞的通透性，抑制内皮细胞损伤。

综上所述，miR-98在动脉粥样硬化早期可能通过抑制ox-LDL诱导的内皮细胞损伤作用进而抑制NF-κB炎性信号通路以及下游调控蛋白的激活，从而延缓AS的发展，为AS的治疗提供了潜在靶点。