莱菔硫烷对过氧化氢诱导人脐静脉血内皮细胞损伤的保护作用及机制研究

康小荣，张明升，秦纲

莱菔硫烷作为异硫氰酸盐类化合物，因具有抗氧化、抑制肿瘤、心血管保护等治疗作用，再加上蔬菜西兰花中含量丰富，近年来成为国内外研究热点。研究显示，莱菔硫烷本身并不直接参与抗氧化反应，它与谷胱甘肽和蛋白巯基反应，通过间接途径激活Nrf2，诱导产生一系列二相酶和抗氧化酶实现抗氧化作用[1]。因此莱菔硫烷对氧化损伤的内皮细胞可能也有保护作用，但相关报道尚不多见。本实验以H2O2干预人脐静脉血内皮细胞（HUVEC）建立氧化应激模型，旨在明确莱菔硫烷对氧化损伤的内皮细胞是否具有保护作用，并进一步探讨其可能机制，为探讨莱菔硫烷的心血管保护作用提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂实验对象来源于人脐静脉血内皮细胞株HUVEC（中科院细胞库）。胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）。含0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青链霉素混合液、二甲基亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT）粉、PBS粉（北京索莱宝生物科技公司)。莱菔硫烷、过氧化氢（美国sigma公司）。DMEM高糖培养基（美国Hyclone公司）。ROS检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)。YBR Green PCR 试剂盒（KAPA Biosystems）。TRIzol试剂（ambion）。逆转录试剂盒（TAKARA）。DNaseⅠ（Fermentas）。SMATB全自动酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。流式细胞仪（BECKMAN公司）。荧光定量PCR仪（Real-Time System）。PCR 仪（T100-Thermal Cycler）。水平电泳设备（DYC-31D）。凝胶成像系统（Universal Hood Ⅱ）。

1.2 细胞培养及实验分组复苏冻存的HUVEC，培养液是含10%的胎牛血清、1%青链霉素混合液的高糖DMEM，在37℃、5%CO2条件下培养细胞至80%融合度时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化传代。实验分组：①空白对照组（对照组）：细胞正常培养2.5 h；②过氧化氢组（H2O2组）：分别给予100、200、400、600、800 μmol/L浓度培养细胞2 h，选择400 μmol/L为其最佳干预浓度（后续各组如未特殊注明，默认H2O2浓度为400 μmol/L）；③莱菔硫烷+过氧化氢组（SFN+H2O2组）：不同浓度SFN（2.5、5、10 μmol/L）预孵育30 min后，加入400 μmol/L的H2O2继续培养2 h。

1.3 MTT法测定HUVEC细胞活性HUVEC按4×103/ml密度接种到96孔板，每孔200 μl。待细胞生长融合达80%后，分别依照实验分组干预2.5 h，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/m1），继续孵育4 h，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO（二甲基亚砜）150 μl，振荡10 min，使结晶物充分溶解。使用全自动酶标仪，测定并记录各孔在波长为570 nm处的吸光光度值（A值），设对照组HUVEC的细胞活性为100%，实验组A值/对照组A值表示其活性。

1.4 流式细胞仪测定细胞内ROS水平细胞按1×105个/ml密度接种于6孔板，每孔1 ml。收集各组细胞，去除培养基，细胞收集后悬浮于浓度为10 μmol/L的DCFH-DA探针中，使细胞浓度为 1×107/ml，继续孵育20 min，每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。然后用无血清培养基洗涤3次，流式细胞仪测定并记录各样本的ROS相对水平。

1.5 逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR法）测定Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表达水平细胞按2×105个/ml密度接种于6个小培养皿，每孔2 ml。收集各组细胞，用TRIzol提取细胞总RNA，反转录cDNA并扩增目的基因，设β-actin为内参照。Nrf2引物序列为5＇-GGTAAGAATAAAGTGGCT-3＇和5＇-TTGTTTTTTCAGTAGGTG-3＇；HO-l引物序列为5＇—TTCAGAAGGGTCAGGTGT-3＇和5＇-AGTAGAGTGGGGCATAGA-3＇；β—actin引物序列为5＇-CCACTCCTCCACCTTTG-3＇和5＇-CACCACCCTGTTGCTGT-3＇。各引物序列用Qbase plus软件设计。总RNA（500 ng）反转录为cDNA，建立20 μl反应体系，42℃孵育60 min，70℃孵育15 min，16℃，保持；反转录产物置于-20℃保存备用。将制备好的cDNA进行PCR扩增，建立20 μl反应体系，反应条件为：95℃，3 min预变性；95℃，5 sec变性；56℃，10 sec退火；72℃，25 sec延伸；39 个循环；65℃，5Sec；95℃，50 Sec。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳，用Universal Hood II凝胶成像系统成像，记录并用△△Ct法计算Nrf2、HO-1基因的相对表达量。

1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析。计量资料用（±s）表示。经正态分布检验、方差齐性检验后，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2作用于HUVEC细胞后细胞存活率下降，SFN预处理后逆转H2O2对HUVEC细胞存活率的影响H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L组的细胞活性依次为对照组的96.5%、84.4%、61.4%、58.0%和54.4%（P＜0.05），选择400 μmol/L为其有效干预浓度（后续各组如未特殊注明，默认H2O2浓度为400 μmol/L）。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L单独作用后各组细胞活性依次为对照组的98.2%、93.1%、89.0%（P＜0.05）。SFN 2.5、5、10 μmol/L预孵育30 min后加入H2O2，各组细胞活性依次为对照组的69.4%、82.9%、86.9%（与H2O2组比较，P＜0.05）（图1）。

2.2 SFN预处理后减少H2O2所致HUVEC细胞内ROS生成H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L组的ROS水平依次为对照组的为1.25、3.45、6.71、6.78、6.78（P＜0.05）。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L预孵育30 min后加入H2O2，各组细胞ROS水平依次为H2O2组的0.82、0.74、0.50（P＜0.05）（图2）。

2.3 SFN预处理后逆转H2O2所致HUVEC细胞Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表达水平H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L组的Nrf2 mRNA水平依次为对照组的0.86、0.40、0.32、0.14、0.05（P＜0.05），HO-1 mRNA水平依次为对照组的为0.92、0.40、0.27、0.17、0.09（P＜0.05）。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L预孵育30 min后加入H2O2，各组细胞Nrf2 mRNA水平依次为H2O2组的1.10、1.39、2.05（P＜0.05），HO-1 mRNA水平依次为H2O2组的1.58、1.74、1.97（P＜0.05）（图3）。

图1 MTT法检测各组细胞活性的结果

图2 流式细胞仪检测各组细胞ROS相对水平

图3 RT-PCR法检测各组细胞Nr f2 mRNA、HO-1mRN相对水平的结果

3 讨论

流行病学研究表明，莱菔硫烷摄入量与心血管疾病风险降低有关[2]。实验观察到SFN可以降低自发性高血压性卒中大鼠脑动脉的氧化应激和炎症[3]。在健康志愿者的实验中，血浆中的SFN可以被迅速消除，但它诱导抗氧化酶产生使得血管生理效应可以延长到24 h[4]。动物和人体实验都证实了SFN对心血管疾病的保护作用，包括高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注、糖尿病及糖尿病并发症等[5]。本研究从体外培养人脐静脉血内皮细胞，建立内皮细胞氧化应激模型，探讨莱菔硫烷对氧化损伤的内皮细胞是否也有保护效应。

血管内皮细胞合成并释放多种生物活性分子，调节血管扩张与收缩、溶解血栓，维持血管壁内部稳态。血管内皮功能障碍导致一氧化氮生物利用度降低和心血管疾病的发生，是动脉粥样硬化发病的第一步[6]。内皮功能障碍与常见疾病的发病机制密切相关，氧化应激、缺氧和血流紊乱是与内皮功能障碍相关的重要因素[7]。

H2O2作为一种机体产生的活性氧（ROS），低浓度时可作为信号分子调节基因表达和信号传导，高浓度的H2O2则会引起氧化应激[8]。以H2O2干预人脐静脉血内皮细胞（HUVEC）建立氧化应激模型[9]，通过MTT法和流式细胞仪分别检测HUVEC中的细胞活性和ROS表达水平。实验结果显示：随着过氧化氢浓度升高，细胞活性逐步降低，ROS表达水平逐渐升高，这表明H2O2浓度依赖性地损伤内皮细胞，并且证明氧化应激是损伤内皮细胞的可能机制之一。SFN预处理细胞后，随着SFN浓度升高，被H2O2抑制的细胞活性升高，ROS表达水平降低，这提示莱菔硫烷可以对抗内皮细胞损伤，这种作用可能与其抗氧化和抗炎作用有关，而且SFN的这种保护作用呈浓度依赖性。

生理条件下机体抗氧化防御机制包括多种活性氧清除酶、Ⅱ相解毒酶及其他抗氧化剂，每种抗氧化剂在其启动子区域都有细胞核结合抗氧化元件（ARE）。Nrf2作为关键的转录因子，通过调控多种ARE途径控制一系列下游靶基因，包括血红素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶-1（NQO1）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）和硫氧还蛋白（TRX），在ROS损伤细胞过程起着重要作用[10]，起到减少细胞凋亡，延缓衰老和减少器官损伤等多方面的作用[11]。小鼠实验证明，Nrf2表达增加使得Ⅱ相解毒酶活性增强，间接保护氧化低密度脂蛋白介导的巨噬细胞损伤，而Nrf2表达减少增加泡沫细胞形成和促进动脉粥样硬化[12]。同时还有研究表明，Nrf2的下游靶基因HO-1通过降低氧化低密度脂蛋白诱导单核细胞再生抑制动脉粥样硬化形成，在抗动脉粥样硬化过程起着至关重要的作用[13]。

本实验以RT-PCR法检测HUVEC中的Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表达水平。低水平的氧化应激会激活细胞自身抗氧化机制，刺激Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表达水平增高，对内皮细胞有保护作用。实验结果显示，高浓度H2O2作用于细胞后，Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表达水平显著降低，提示高浓度H2O2对细胞整体的损伤作用超过了其自身保护机制。在使用SFN预处理后，较H2O2损伤的细胞，细胞活性升高，ROS水平下降，Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表达水平明显提高，且呈明显浓度依赖性，提示SFN可以通过激活Nrf2/HO-1途径增强细胞抗氧化损伤的作用。

综上所述，本实验初步探讨了SFN对H2O2致HUVEC损伤的保护作用，提示一定范围内SFN对内皮细胞的抗氧化损伤作用。进一步研究发现，SFN在转录水平激活Nrf2/HO-1途径在这一过程中起到了关键作用，为利用SFN对心血管疾病进行治疗提供了基础实验和理论依据。但Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达水平如何以及SFN是否还通过其他途径对抗细胞损伤，还需要进一步探讨。