食品中蜡样芽孢杆菌的分离及携带毒力基因的检测

白凤岚，陈松，罗梦幽，曾宝锋，唐俊妮

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种革兰氏阳性菌，能形成芽孢的条件致病菌，广泛存在于土壤、空气、水及植物源、动物源加工的食品中，导致腹泻型或呕吐型食物中毒，是一种常见食源性条件致病菌[1,2]。蜡状芽孢杆菌腹泻型毒素是一种多元化毒素，目前鉴定出的主要包括溶血素HBL（Hemolysin BL）、非溶血性肠毒素Nhe（Nonhemolytic enterotoxin）、细胞毒素CytK（Cytotoxin K）、肠毒素T（BceT）和肠毒素FM (EntFM)等。溶血素Hbl基因组成一个操纵子，通常由hblA、hblB、hblC、hblD四个基因组成，也有的缺失hblB基因，只由hblA、hblC、hblD三个基因组成，分别编码L2蛋白、L1蛋白、B蛋白。非溶血性肠毒素（NHE）由nheA、nheB、nheC三个基因组成一个操纵子，其分泌的蛋白能引起食物中毒。细胞毒素K是一类穿孔毒素，能在细胞磷脂双分子上形成孔洞，破坏细胞的完整性以及离子平衡，对细胞产生致死作用[3～5]。蜡状芽孢杆菌呕吐毒素 Cereulide是一种环形的小分子肽，抗热性强，对各种物理和化学因素不敏感，一般的食品加工过程无法将其破坏，引发食物中毒，并伴有呕吐症状。呕吐型蜡样芽孢杆菌的目标基因为ces和cer。另外，蜡样芽孢杆菌的看家基因groEL、gyrB、rpoB、vrrA在所有菌株中可检出，用于菌株的辅助鉴定[6]。目前在我国食品安全相关标准中，对蜡样芽孢杆菌的限量值并没有明确规定，致使食品生产过程中对该菌的控制不明确，因此，有必要了解食品中蜡样芽孢杆菌的潜在毒性及威胁。

本实验通过对成都市售卖的食品进行采样并分离污染的蜡样芽胞杆菌，检测其毒力基因，以了解成都市食品中蜡样芽孢杆菌的污染状况。获得的数据对食品中蜡样芽孢杆菌的防控措施具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 培养基及试剂

氯化钠、异戊醇、冰乙酸购于天津市致远化学试剂有限公司；甘露醇卵黄多粘菌素培养基（MYP)、多粘菌素 B、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）购于青岛高科园海博生物科技有限公司；SDS购于成都市科龙化工试剂厂；Tris饱和酚购于北京博奥拓达科技有限公司；无水乙醇购于成都海兴化学试剂厂；1×TE缓冲液；1×TAE缓冲液；甘油购于天津市瑞金特化学品有限公司；REGULAR AGAROSE G-10型琼脂糖购于BIOWEST公司；GELVIEW 核酸染料及 DL 2000 Marker购于宝生物工程(大连)有限公司；PCR引物购于上海生物工程有限公司；Master Mix购于北京擎科新业科技有限公司。

1.2 仪器及设备

SW-CJ-2FD洁净工作台购于苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HP-9080水式恒温培养箱购于上海齐欣科学仪器有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱购于江苏省太仓市实验设备厂；AKHL-III-24艾柯超纯水机（台湾艾柯）购于成都康宁实验专用纯水设备；MLS-3020电热自动灭菌锅购于日本SANYO公司；Eppendorf冷冻离心机5804 R型购于Eppendorf中国有限公司；Applied Biosystems 2720购于Thermal Cycler基因有限公司；凝胶成像仪、SC-15数控超级恒温槽购于宁波新芝生物科技股份有限公司；DYY-6C型电泳仪购于北京六一仪器厂；PL 303电子天平购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；WD 800B型微波炉购于顺德市格兰仕微波炉电器有限公司；恒宇202-3-5型电热恒温干燥箱购于上海跃进医疗器械。

1.3 方法

1.3.1 食品样品的采集

样品采集时间为2016年4月至2016年9月。在成都市附近的农贸市场及路边小摊共采集不同生鲜食品样品130份，样品包括：米面制品52份，熟肉制品33份，豆制品24份，凉拌食品15份，生肉3份，奶制品3份。采集的样品当天送入实验室进行分离培养。

1.3.2 蜡样芽孢杆菌的分离与培养纯化

所有采集样品均在无菌条件下进行处理。按照GB 4789.14-2014《食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验》进行检验。

1.3.3 细菌的16S rRNA鉴定

无菌吸取100 μL保菌液接种到TSB培养基中，于（37±1）℃振荡培养箱恒温活化培养12 h～18 h，采用 Tris-饱和酚-氯仿法提取细菌的 DNA[7]。利用细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列(5'→3')为：16S-27-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S-1492-R：GGTTACCTTGTTACGACTT。反应体系为20 μL，其中MIX 10 μL，超纯水8.2 μL，上游引物16S-27-F 0.4μL，下游引物16S-1492-R 0.4 μL，分离菌株DNA 1 μL，空白对照组不加模板DNA，用无菌超纯水水补足至20 μL体积。PCR反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，35 个循环，72 ℃ 10 min。以TAE为电泳缓冲液，在120 V电压，90 mA电流下，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并利用凝胶成像系统检测，将剩余的扩增产物送往成都擎科生物公司进行测序比对，利用BLAST确定分离菌株菌属。

1.3.4 蜡样芽孢杆菌携带看家基因和毒力基因的检测

利用蜡样芽孢杆菌不同的毒力基因引物进行PCR扩增，反应体系为20 μL，其中MIX 10 μL，超纯水8.2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，分离菌株DNA模板1 μL，空白对照组用无菌超纯水补足至20 μL。引物序列和退火温度及其扩增产物大小见表1。PCR反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，不同退火温度 50 s，72 ℃ 40 s，35 个循环，72 ℃ 10 min。以TAE为电泳缓冲液，在120 V电压，90 mA电流下对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并利用凝胶成像系统检测。

表1 本研究所用的引物Table 1 The primers used in this study

2 结果与分析

2.1 食品样品中蜡样芽孢杆菌的分离与初步鉴定

由于蜡样芽孢杆菌不能利用D-甘露醇，因此不产酸，在MYP选择培养基中酚红指示剂作用下，菌落形态为典型的粉红色。此外，由于蜡样芽孢杆菌产生卵磷脂酶，在MYP培养基中卵黄乳液作用下，会在菌落周围产生2～5 mm沉淀环，菌落较大，表面比较干燥。通过形态学分析，结合16S rDNA的测序结果。本研究从成都市市售食品 130份样品中分离得到 23株蜡样芽孢杆菌分离菌株，检出率为17.7%。其中，分离菌株大多数来自于肉制品、米面制品及豆制品类。具体样品来源和样品名称及采样时间详见表2。

表2 采样来源及采样时间Table 2 The Sampling sources and time

2.2 蜡样芽孢杆菌毒力基因鉴定结果

对分离的23株蜡样芽孢杆菌菌株进行4个管家基因 gyrB、rpoB、VrrA、groEL的检测，结果表明 23株蜡样芽孢杆菌分离菌株的4个管家基因gyrB、rpoB、VrrA、groEL检出率为100%。进一步确认23株分离菌株为蜡样芽孢杆菌。随后，对以上23株分离菌株进行毒力基因检测，结果详见表3，由表3可以看出：23株分离菌株中，有19株至少检测出一种及以上的毒力基因，有4株不携带任何待检的毒力基因。在13种检测的毒力基因中，nheB和entFM在16株分离菌株中出现，检出率为69.6%；nheA和nheC在14株分离菌株中出现，检出率为60.9%；hblD在11株分离菌株中出现，检出率为47.8%；cytK在10株分离菌株中出现，检出率为43.5%；bceT在9株分离菌株中出现，检出率为39.1%；hblA和hblC在8株分离菌株中出现，检出率为34.8%；cer和ces在2株分离菌株中出现，检出率为8.7%；未发现分离菌株携带hblB和hly-II基因。

表3 蜡样芽孢杆菌分离菌株中毒力基因的携带情况Table 3 The detection results of virulence genes in Bacillus cereus food isolates

BC-16-3 - - - + - - + + + + - + - 6 BC-16-4 - - + - - - + - - - - + - 3 BC-16-5 - - - - - - + - - - - - - 1 BC-16-6 - - - - - - - - - - - - - 0 BC-16-7 - - - - - - - - - - - - - 0 BC-16-8 - - - - - - - - - - - - - 0 BC-16-9 - - - + - + + + + + + + - 8 BC-16-10 - - + - - - - - + + + + - 5 BC-16-11 - - + - - - - - + + + + - 5 BC-16-12 - - + + - + + + + + + + - 9 BC-16-13 - - - + - + + + + + + + - 8 BC-16-14 + + - - - - - + + + - + - 6 BC-16-15 - - + - - + + + + + + + - 8 BC-16-16 + + - - - - - + + + - - - 5 BC-16-17 - - - - - - - + + + - + - 4 BC-16-18 - - - - - - - + + + - + - 4 BC-16-19 - - + - - - - + + - - + - 4 BC-16-20 - - + + - + + + + + + + - 9 BC-16-21 - - - - - - - - - - + - - 1 BC-16-22 - - - - - - - - - - - - - 0 BC-16-23 - - + + - + + + + - + + - 8合计 2 2 10 8 0 8 11 14 16 14 9 16 0检出率/% 8.70 8.70 43.48 34.78 0 34.78 47.82 60.87 69.57 60.87 39.13 69.57 0

3 结论

3.1 近年来，我国各省市都有报道由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件，对各省市各类食品进行采样都有检出蜡样芽孢杆菌污染。如刘桂丹和范正轩[8]对自贡市婴幼儿食品、水及水产品、乳及乳制品等进行食源性致病微生物检测，发现蜡样芽孢杆菌检出率为12.70%；宋曼丹等[9]对广东省婴幼儿食品进行检测，检出率为28.67%。刘琪等[10]对采自市场上的13个发酵豆制品进行蜡样芽孢杆菌进行检测，发现几类发酵豆制品中均检出了蜡样芽孢杆菌，总检出率高达84.6%。赵薇等[11]对 2011～2015年吉林省不同地区各流通环节的样品进行蜡样芽孢杆菌检测，总检出率为32.9%。本研究的采样时间是2016年4～9月期间，共采集了成都市农贸市场及路边小摊的各类食品样品130份，包括米面制品、肉制品、豆制品和奶制品等，采集的样品中蜡样芽孢杆菌的检出率为17.7%。我们的结果与王君[12]对成都市食品中蜡样芽孢杆菌的检出率20%以及田万帆等[6]2014年从成都市农贸市场和路边小摊采集的食品中蜡样芽孢杆菌的检出率为24%比较接近。说明成都市售卖的各种食品中存在一定的蜡样芽孢杆菌污染。通过进一步对本研究检出的蜡样芽孢杆菌样品进行分析，发现米面制品及豆制品的污染情况比较严重，我们的结果与上述其他研究结果较为一致。蜡样芽孢杆菌主要以孢子状态广泛存在于自然界和食品中，尤其是谷物等淀粉含量高的食品[13]。其他文献也报道，米粉、米线、凉皮和盒饭等含有米饭或米制品的食品为蜡样芽孢杆菌污染的主要食品种类[6,11]。在多起蜡样芽孢杆菌食物中毒事件中，被污染的食品主要为剩米饭（44.6%）和开水泡饭（17.0%）[14]。在夏季，米饭和凉拌食品如凉面、凉皮等原料本身容易被蜡样芽孢杆菌污染，加上长时间暴露于高温环境中，引起食物中毒的风险大大增加，应当给予重视。中国疾病预防控制中心的《食源性疾病监测工作手册》也将米饭和米粉中的蜡样芽孢杆菌作为重点监测项目。

3.2 蜡样芽孢杆菌是内生孢子型细菌种类，可产生许多种毒素，最容易引起食物中毒的两种毒素是不耐热肠毒素（容易被热破坏）和致吐毒素（食品被热处理也不能灭活此毒素）[15]。本研究中，对于分离的 23株蜡样芽孢杆菌所携带的毒力基因进行检测发现，呕吐型蜡样芽孢杆菌检测的目的基因ces和cer检出率较低（8.7%），仅在BC-16-14和BC-16-16中出现，其产生的致吐毒素 Cereulide在一般的食品加工过程中不能灭活，因此，还是应当引起足够的重视。王利国[16]等研究认为只有当菌株含有hblA，hblC，hblD全部三个毒力基因时，该菌株才会产生溶血毒素 Hbl。我们的检测结果可以看到，23株分离菌株中有7株菌株（BC-16-1、BC-16-2、BC-16-9、BC-16-12、BC-16-13、BC-16-20、BC-16-23）含有全部三个基因，说明这 7株分离菌株是可以产生溶血毒素 Hbl，对消费者会产生危害。此外，非溶血肠毒素nhe基因的检出率较高，nheA和nheC为60.9%，nheB为69.6%，同样能引起消费者腹泻等不良反应，不可忽视。李毅等[17]针对温州地区食品中蜡样芽孢杆菌的污染情况进行研究，检出蜡样芽孢杆菌39株，发现所有的菌株携带至少一个毒素基因，其中，12.8%的菌株携带呕吐毒素基因并同时携带复合型非溶血性肠毒素nhe基因，他们的研究认为非溶血性肠毒素nhe基因、entFM基因、bceT基因是分离菌株主要毒素基因。我们的研究结果同样发现nhe，cytK，entFM和bceT基因的检出率偏高。这些毒力基因编码的毒素也被认为是我国食源性蜡样芽孢杆菌的主要毒力因子[5]。如果消费者不小心摄入了被上述蜡样芽孢杆菌污染的食品，引起食物中毒的风险较大，且产生腹泻等不良反应的可能性高于呕吐等不良反应。综上，本实验通过对成都市售卖食品进行采样，进行了蜡样芽胞杆菌的分离鉴定，并对其携带的毒力基因进行调查，了解了成都市食品中蜡样芽孢杆菌的污染情况，获得的数据对蜡样芽孢杆菌引起的食品安全问题具有指导意义。