构建及应用针对非小细胞肺癌整合素αvβ3受体靶向性纳米分子探针：体外实验研究

沈爱军，张旭南，李永勇，冯 峰，张建泉，王培军*

(1.同济大学附属同济医院影像科，上海 200065；2.南通大学附属肿瘤医院影像科，江苏 南通 226361；3.同济大学医学院生物医学工程与纳米科学研究院，上海 200092)

在我国，肺癌的发生率和致死率高居恶性肿瘤首位[1]，早期、精准诊断以及准确评估肺癌恶性程度和转移可能性，对于降低患者死亡风险、改善预后具有重要意义。整合素家族中的αvβ3亚型在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中呈高表达，并与肿瘤增殖、侵袭及转移能力相关[2-4]。通过检测肺癌组织中整合素αvβ3的表达情况，可以实现对肺癌的精准诊断和风险评估。但是，目前检测肺癌组织中整合素αvβ3的表达基本依赖于组织学方法，须手术或活检后才能获得结果。分子影像学的兴起，特别是各种新型纳米分子成像探针的研发，为无创评价肺癌组织中整合素αvβ3的表达提供了可能[5]。本研究旨在构建以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(RGD)为靶向基团、牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)为载体、Gd为成像剂的新型MR纳米分子成像探针RGD-Gd@BSA，并通过体外细胞实验，探讨其用于NSCLC精准诊断和风险评估的可行性。

1 材料与方法

1.1主要材料 BSA(北京鼎国生物技术有限公司)；RGD[吉尔生化(上海)有限公司]；六水氯化钆 (GdCl3·6H2O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；钆喷酸葡甲胺注射液(Gd-DTPA，北京北陆药业股份有限公司)；马来酰亚胺-聚乙二醇2000-N-羟基琥珀酰亚胺(Mal-PEG2000-NHS，北京键凯科技股份有限公司)；N-乙基马来酰亚胺(NEM，Sigma Aldrich)；二氢卟吩e6(Ce6，Frontier Scientific)；肺腺癌A549细胞株和人胚肾293T细胞株(中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)。

1.2分子成像探针RGD-Gd@BSA的合成 将5 ml GdCl3·6H2O溶液(0.4 mg/ml)在磁力搅拌下缓慢滴入10 ml BSA溶液中，得到乳白色溶液，继续滴加 5 ml NaOH溶液(0.2 mg/ml)，至溶液澄清后继续室温下搅拌1 h，超速离心(4 500 r/min)下超滤15 min除去未反应的Gd3+，得到产物Gd@BSA。调节Gd@BSA溶液pH值至7.2，将5 ml NEM溶液 (0.5 mg/ml)缓慢滴入Gd@BSA溶液中，室温下反应2 h，透析去除多余NEM。调节pH值至8.0，向溶液中滴加5 ml Mal-PEG2000-NHS溶液(0.6 mg/ml)，继续反应2 h，透析去除多余Mal-PEG2000-NHS。调节pH值至7.0，向溶液中滴加巯基修饰的RGD溶液 5 ml (3 mg/ml)，室温搅拌反应24 h，得到产物RGD-Gd@BSA。加入光敏剂Ce6，反应后获得Ce6修饰的RGD-Gd@BSA。

1.3分子成像探针RGD-Gd@BSA的相关表征 以X线透射电镜观察RGD-Gd@BSA的形态，以纳米激光粒度分析仪(型号NanoZS90)检测RGD-Gd@BSA的水合动力学直径和Zeta电位，观察24 h内RGD-Gd@BSA在不同溶液(去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液及细胞培养液)中的粒径变化，评价分子探针的溶液分散稳定性。配置不同Gd3+浓度(0.15、0.30、0.60、1.20和2.40 μmol/L)的Gd@BSA和RGD-Gd@BSA溶液，以3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT]比色法检测含不同Gd3+浓度Gd@BSA和RGD-Gd@BSA溶液中人胚肾293T细胞的存活率，评价纳米材料的生物安全性。

配置不同Gd3+浓度(0.022、0.043、0.087、0.173、0.347、0.693 mmol/L)的RGD-Gd@BSA和Gd-DTPA溶液，以体外磁场发生仪(型号MFG-1000)分别检测不同Gd3+浓度下RGD-Gd@BSA和Gd-DTPA的T1值，将T1值倒数与相应的Gd3+浓度线性拟合，分别得到两者的T1弛豫率。同时对两者行MR扫描，获得T1WI。采用Siemens Magnetom Verio 3.0T MR扫描仪，头颈线圈。扫描参数：TR 600 ms，TE 15 ms，层厚2 mm，FOV 150 mm×150 mm。

图1 RGD-Gd@BSA的形貌及尺寸 A.X线透射电镜图； B.水合动力学直径

图2 RGD-Gd@BSA在不同溶液中的分散稳定性 A.去离子水； B.生理盐水； C.磷酸盐缓冲液； D.细胞培养液

1.4A549细胞靶向性荧光成像 取对数生长期的A549细胞，接种于6孔板中，细胞数3×105个/孔，于饱和湿度、37℃、5% CO2浓度的培养箱中孵育24 h，分别加入光敏剂Ce6修饰的RGD-Gd@BSA(靶向组)和Gd@BSA(非靶向组)溶液(Gd3+浓度为 0.6 μmol/L，2 ml/孔)，每组3个复孔，继续孵育2 h。以磷酸盐缓冲液冲洗细胞2遍，加入4%多聚甲醛，每孔 1 ml，室温下固定10 min。去除多聚甲醛并以磷酸盐缓冲液冲洗细胞后，每孔加入0.5 ml DAPI溶液室温避光染色5 min。去除DAPI并以磷酸盐缓冲液冲洗细胞，滴加抗荧光淬灭封片剂，密封避光保存。荧光共聚焦显微镜下分别行细胞成像(激发波长488 nm，接收630 nm)。

1.5A549细胞靶向MRI 细胞接种培养同荧光共聚焦成像实验，孵育24 h后分别加入RGD-Gd@BSA(靶向组)和Gd@BSA(非靶向组)溶液，每组2个Gd3+浓度梯度(0.050和0.025 mmol/L)，继续孵育1.5 h。以磷酸盐缓冲液冲洗细胞、胰酶消化、离心，所得细胞团以磷酸盐缓冲液制成细胞悬液，分别置入2 ml EP管内，获取MR T1WI，参数同前；勾画ROI，测量其T1WI相对信号强度。

1.6统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。以独立样本t检验比较2组间T1WI信号强度的差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1RGD-Gd@BSA的表征 X线透射电镜显示RGD-Gd@BSA呈类球形，形貌均一，平均水合动力学直径为(99.52±2.62)nm(图1)；Zeta电位为(-11.07±0.42)mV。在去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液及细胞培养液4种不同溶液中，RGD-Gd@BSA分散稳定，连续观察24 h，RGD-Gd@BSA的水合动力学直径变化幅度分别为37.46%、14.62%、25.10%和21.24%(图2)。体外水溶液MRI显示，各浓度RGD-Gd@BSA溶液的T1WI信号强度均高于Gd-DTPA(图3A)，RGD-Gd@BSA弛豫率为18.615 L/(mmol·s)，而Gd-DTPA为3.404 L/(mmol·s)；见图3B。

2.2细胞毒性试验 随Gd3+浓度增加，Gd@BSA和RGD-Gd@BSA对293T细胞均表现出较好的生物相容性，在Gd3+浓度为0.15、0.30、0.60、1.20和2.40 μmol/L的纳米探针溶液中，人胚肾293T细胞的存活率分别为：Gd@BSA，81.42%、77.90%、81.44%、77.32%和67.43%；RGD-Gd@BSA，81.74%、86.80%、69.83%、78.41%和66.95%(图4)。

图3 不同Gd3+浓度RGD-Gd@BSA及Gd-DTPA溶液体外MR成像效果 A.T1WI； B.T1弛豫率拟合图

图4 不同Gd3+浓度Gd@BSA和RGD-Gd@BSA下人胚肾293T细胞的存活率柱形图

2.3A549细胞靶向性荧光成像 荧光共聚焦显微镜下，Gd@BSA和RGD-Gd@BSA均能被人肺腺癌A549细胞吞噬摄取，对RGD-Gd@BSA的摄取多于Gd@BSA，产生更高的荧光强度(图5)。

2.4A549细胞靶向MRI Gd3+浓度为0.050 mmol/L和0.025 mmol/L时，靶向组(RGD-Gd@BSA)细胞悬液T1WI相对信号强度均高于非靶向组(Gd@BSA)，差异均有统计学意义(t=3.907、2.845，P=0.017、0.047，图6)。

3 讨论

在我国，肺癌的发病率和死亡率急剧上升，已居恶性肿瘤之首。在组织学分型上，NSCLC占肺癌的85%以上[6]。临床约80%肺癌患者确诊时已失去手术机会，50%患者在初次确诊时已发生转移[7]。因此，早期、精准诊断和准确判断预后，对于肺癌患者治疗方案选择和提高疗效具有重要意义。影像学，特别是CT、MRI的广泛应用和不断发展，极大地提高了肺癌患者病灶的检出率，然而在肿瘤病灶定性诊断的准确率以及对早期小病灶空间定位的敏感度方面，常规影像学检查技术还有一定局限性。

图5 分子成像探针靶向肺腺癌A549细胞荧光共聚焦成像(×40) A～C.靶向组(RGD-Gd@BSA)； D～F.非靶向组(Gd@BSA) (DAPI：细胞核荧光染料，呈蓝色荧光；Ce6：染色探针，呈绿色荧光；Merged：二者融合图像)

图6 人肺腺癌A549细胞不同Gd3+浓度下T1WI和相对信号强度柱形图 A.靶向组T1WI； B.非靶向组T1WI； C.T1WI相对信号强度柱形图(*：P<0.05)

分子影像学技术的飞速发展，提高了影像医学对肿瘤的诊断效能。恶性肿瘤诊断效能主要包括敏感度和特异度两个方面，而基于纳米技术的各类新型分子成像探针的研发能够同时提升敏感度和特异度[8]。基于MRI的分子探针研发成为分子影像学研究领域的热点，而选择合适靶点是构建肿瘤特异性MR分子成像探针的关键。研究[2,9-10]表明，整合素αvβ3在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁组织，并与肿瘤分化程度、病理分期、侵袭转移密切相关；且整合素αvβ3能特异性识别含RGD的配体，并通过配体-受体结合的方式调节肿瘤的生物学行为[11]。因此，本研究以整合素αvβ3为靶点，RGD为靶向基团，Gd为成像剂，构建MR分子成像探针，以期实现对NSCLC的特异性诊断。

MR分子成像探针在肿瘤区产生特异性MR信号的首要条件是探针能够顺利到达靶组织，然后通过靶向基团(配体)与靶点(受体)特异性结合，使探针在肿瘤内特异性富集。机体内的网状内皮吞噬系统(reticuloendothelial system， RES)或单核巨噬细胞吞噬系统(mononuclear phagocyte system， MPS)对进入体内的纳米颗粒的吞噬清除，是阻碍分子成像探针顺利到达肿瘤靶区的重要因素。研究[12]表明，纳米颗粒粒径为100～200 nm，可有效减少RES或MPS的吞噬，延长其在血液循环中的时间，进而提升纳米颗粒进入肿瘤组织的有效数量。本研究制备的分子成像探针RGD-Gd@BSA粒径为(99.52±2.62)nm，理论上可有效避免RES或MPS的吞噬，保证其到达肿瘤靶区的有效数量。溶液分散稳定性亦是决定探针能否顺利进入肿瘤靶区的重要因素。本研究以BSA为载体，分子探针表面带负电荷[Zeta电位为(-11.07±0.42)mV]，保证其具有很好的溶液分散稳定性。

MR分子成像探针在肿瘤区产生特异性MR信号的另一个重要条件是探针本身的T1弛豫能力。对于以Gd为代表的顺磁性MR对比剂，根据经典的SBM(Slomon-Bloembergen-Morgen)理论[13]，提升其T1弛豫率的方法主要包括：①减慢自旋时间；②延长结合水分子的停留时间；③增加结合水分子的数量。本研究设计的分子成像探针RGD-Gd@BSA因存在BSA蛋白载体而分子量较高，能够有效延长自旋时间，且大分子蛋白本身具有一定的对水分子的束缚作用，故RGD-Gd@BSA具有明显高于Gd-DTPA对比剂的弛豫率，以提高其T1成像能力。

为验证RGD-Gd@BSA对NSCLC的靶向能力，本研究分别进行A549细胞靶向性荧光成像和MRI，通过向BSA疏水区内引入光敏剂Ce6的方法，赋予探针产生荧光的能力。荧光共聚焦显微镜下，靶向组A549细胞质内的荧光强度高于非靶向组，表明RGD-Gd@BSA对肺癌A549细胞具有更高的亲和力。MRI实验结果亦表明，靶向组细胞悬液的T1WI相对信号强度高于非靶向组，且差异有统计学意义，提示RGD-Gd@BSA具有NSCLC靶向性MR成像的能力。

总之，本研究设计合成的RGD-Gd@BSA具有较好的生物相容性和溶液分散稳定性、较高的T1弛豫率和对肺癌A549细胞的靶向性，可作为用于NSCLC早期、精准诊断和预后评价的MR分子成像探针，值得进一步研究。