好要汤薄层鉴别及其鞣花酸含量测定研究△

钟宇富，刘国洪，陈桂添，杜英娟，时军*

（1.广禾堂草本生物科技（上海）有限公司，上海 200233；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006）

好要汤是一款具有缓解疲劳、促进产后恢复的功能食品，源于妇科临床补肾强腰方，含覆盆子、黄精、玉竹、酸枣仁等中药，具有益气扶正、补肝肾的功效，可提高人体精力，预防早衰，促进人体各项生理功能恢复[1]。该功能食品用于产后虚弱、劳累过度的产妇，效果较好。为控制该产品质量，建立了该制剂中覆盆子、酸枣仁、黄精的TLC定性鉴别方法，并采用HPLC法测定鞣花酸的含量。

1 材料

1.1 仪器材料

BSA124S型电子天平（德国赛多利斯公司）；REX-C700型恒温六孔水浴锅（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；ZF-20D暗箱式紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；202-2AB型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；双槽玻璃层析缸（规格10 cm×10 cm）；玻璃点样毛细管（上海申立玻璃仪器销售有限公司，内径0.3 mm，管长100 mm，硬质中性玻璃）；显色喷雾瓶（上海信谊仪器厂有限公司，021-59331359）；硅胶G薄层板（德国默克公司，规格10 cm×10 cm，厚度0.25 mm）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂，规格10 cm×20 cm，厚度0.20～0.25 mm）。

1.2 试剂和药品

好要汤（广禾堂草本生物科技（上海）有限公司，批号：170423、170521、170617）；覆盆子对照药材、酸枣仁对照药材、黄精对照药材（中国食品药品检定研究院，供薄层鉴别用）；鞣花酸对照品（上海同田生物技术有限公司，质量分数：＞98%，批号：11053121）；椴树苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：112000-201501）；酸枣仁皂苷 A对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110734-201507）；香兰素（天津市福晨化学试剂厂）；甲醇、无水乙醇（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；正丁醇（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；冰醋酸（分析纯，天津市百世化工有限公司）；乙酸乙酯、氯仿、石油醚、甲酸、浓硫酸（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料公司）。

2 方法与结果

2.1 覆盆子薄层鉴别

参考文献方法[2]，取本品3 g，置于150 mL锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣用1 mL乙醇溶解，作为供试品溶液。制备不含覆盆子的产品，按前法同样操作，作为阴性对照样品溶液。精密称取椴树苷对照品6 mg，用6 mL乙醇溶解制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取覆盆子对照药材1 g，置于研钵中研碎，放置于150 mL锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声提取30 min，过滤，滤液蒸干，残渣用1 mL乙醇溶解，作为对照药材溶液[1]。取硅胶 G薄层板，于105℃活化30 min后，分别吸取上述椴树苷对照品溶液、覆盆子对照药材溶液、供试品溶液和阴性对照样品溶液点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（22∶1∶1）为展开剂，展开，晾干，喷以0.5%三氯化铝乙醇溶液，晾干，置于紫外光灯（365 nm）下检视。与对照品与对照药材对应处，供试品显示同样颜色的斑点，见图1。

图1 覆盆子薄层鉴别色谱图

2.2 酸枣仁薄层鉴别

参考文献方法[3]，取本品5 g，加氯仿80 mL，回流提取2 h，弃去氯仿溶液，药渣挥干，残渣再加入甲醇100 mL，回流提取3 h，滤液蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。制备不含酸枣仁的产品，按前法同样操作，作为阴性对照样品溶液。精密称取酸枣仁皂苷A对照品5 mg，用5 mL乙醇溶解制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取酸枣仁对照药材1 g，加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，留滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液[2]。取硅胶G薄层板，于105℃活化30 min后，分别吸取上述酸枣仁皂苷A对照品溶液、酸枣仁对照药材溶液、供试品溶液和阴性对照样品溶液点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）的上层液为展开剂，展开，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液，80℃均匀受热，观察显色斑点。与对照品与对照药材对应处，供试品显示同样颜色斑点，见图2。

图2 酸枣仁薄层鉴别色谱图

2.3 黄精薄层鉴别

取本品3 g，加70%乙醇40 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL溶解，然后加正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。制备不含黄精的产品，按前法同样操作，作为阴性对照样品溶液。称取黄精对照药材1 g，加70%乙醇40 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL溶解，然后加正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液[4]。取硅胶G薄层板，于105℃活化30 min后，分别吸取上述黄精对照药材溶液、供试品溶液和阴性对照样品溶液点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（12∶2∶0.1）为展开剂，展开，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液，90℃均匀受热，观察显色斑点。与对照药材对应处，供试品显示同样颜色斑点，见图3。

图3 黄精薄层鉴别色谱图

2.4 鞣花酸含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Cosmosil Cl8柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-磷酸水溶液（pH＝2.5，B），梯度洗脱（0～15 min，20% ～55%A；15～25 min，55%A）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：254 nm；进样量10μL；柱温：30℃[5]。

2.4.2 溶液的制备 精密称取鞣花酸对照样品0.003 8 g，置于25 mL容量瓶中，用纯甲醇定容，作为浓度为152μg·mL－1的对照品储备液。精密称取颗粒0.4 g，置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇，超声处理40 min，摇匀后静置，取上清液，即得。精密称取阴性对照品颗粒（不含覆盆子）0.4 g，置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇，超声处理40 min，摇匀后静置，取上清液，即得。

2.4.3 系统的适应性与专属性 取供试品溶液（170617批次）连续进6针，进样后HPLC色谱图，对照品和供试品中鞣花酸的保留时间一致，阴性对照无干扰见图4。

图4 好要汤专属性考察图谱

2.4.4 标准曲线和线性范围 精密吸取鞣花酸对照品储备液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL，分别用甲醇依次稀释为 7.6、15.2、30.4、60.8、121.6μg·mL－1等系列浓度的标准溶液。按色谱条件进样测定，记录峰面积，以鞣花酸浓度C为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。得线性方程Y＝2.109 2X－10.102，r＝0.999 4，表明鞣花酸浓度在7.6～121.6μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.4.5 精密度试验 精密吸取鞣花酸对照品溶液10μL，连续进样6次，记录峰面积。结果峰面积RSD值为0.50%，表明鞣花酸测定精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 精密称取好要汤样品（170617批次）0.4 g，按2.4.2供试品溶液的制备方法制备，按2.4.1色谱条件进样分析，分别于0、1、2、4、6、12、24 h进样分析，记录鞣花酸峰面积，结果峰面积RSD值为0.60%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.7 重复性试验 精密称取好要汤样品（170617批次）0.4 g，共6份，按2.4.2供试品溶液的制备方法制备，按2.4.1色谱条件进样分析，结果鞣花酸含量RSD值为2.01%。

2.4.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批好要汤样品（170617批次）6份，每份约0.20 g，分别加入152μg·mL－1对照品溶液0.9 mL，按照2.4.2制备方法制备供试品溶液。进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.4.9 样品含量测定 精密称取好要汤3批产品，每份0.4 g，按2.4.2项下方法制备供试品溶液，进样分析，结果见表2。

表2 不同批次好要汤中鞣花酸含量测定

3 讨论

覆盆子主要成分有鞣质、萜类、黄酮等，药理作用主要有抗诱变、改善学习记忆能力、延缓衰老、增强免疫，对性腺轴有调控作用等[6-7]。鞣花酸为覆盆子中鞣质的主要成分，具有良好的抗炎、抗诱变和抗菌作用等[8-9]。因此本实验选用鞣花酸作为质量检测成分。

本实验对鞣花酸HPLC测定的药典方法进行考察，结果发现乙腈-0.2%磷酸等度洗脱时，基线漂移较严重，鞣花酸分离效果不佳，改用梯度洗脱（0～15 min，20% ～55%A；15～25 min，55%A），鞣花酸出峰时间在17 min左右，分离度好，灵敏度高。