长期定位施肥对中性紫色土硝化作用及氨氧化微生物的影响

赵普生，韩 苗，熊子怡，郭 涛

(西南大学资源环境学院，重庆 400716)

长期定位肥料试验，可以定向培育土壤质量和功能特点显著不同的农田土壤生态系统，可以用作评价不同施肥方式对农业生产以及农田生态系统可持续发展的影响[1-2]。合理施用氮肥是现代农业高产、高效的基础，硝化作用是全球氮素循环的重要中心环节，对土壤生态系统中氮平衡起决定性作用，因此对硝化作用的研究具有重要的农学和环境意义[3-5]。

硝化作用是主要由微生物介导的反应，指在好氧条件下铵态氮被氧化为硝态氮的过程，它是由微生物所驱动的，分别由两类化能自养微生物参与完成：首先是氨氧化微生物(Ammonia-oxidizing microorganisms,AOM)将氨氧化为亚硝态氮，再由亚硝酸氧化细菌(NOB)将亚硝态氮氧化为硝态氮，其中能将氨氧化为亚硝态氮的氨氧化微生物包括氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)[4]。施肥制度的不同可导致土壤微生物数量和活性的不同，继而影响土壤微生物的功能[6]。氨氧化微生物与硝化细菌作为硝化过程的主要参与者不可避免地会受其影响。贺纪正等[7]利用定量PCR和DGGE相结合方法，对我国湖南祁阳旱地长期定位试验点酸性红壤的研究结果显示，长期施肥对土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌数量均有显著影响，且对AOA的群落结构产生了巨大影响。Shen等[8]通过研究河南封丘碱性潮土发现，长期施肥对土壤AOB的数量和群落结构有显著影响，而对AOA数量和群落结构未产生影响。长期不同施肥制度下黄土旱塬黑垆土AOA和AOB群落多样性和丰度也产生了相应的变化[9-10]。

已有研究表明土壤的硝化作用与土壤pH值存在着显著的相关性[11-12]，而在以往的研究中酸碱度为中性的土壤研究较少。因此以国家紫色土肥力与肥料效益监测基地的中性紫色土为研究对象，进行土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌amoA基因的Real-time PCR分析，比较长期不同定位施肥对土壤氨氧化潜势和硝化强度的影响，以期明确氨氧化微生物功能的变化是否响应微生物基因拷贝数的变化，并分析不同施肥制度对功能微生物丰度与功能的影响，为三峡库区农业生态系统中氮素循环的有效管理、提高肥料利用效率提供重要依据。这对于在中性紫色土区建立长效科学的施肥制度，改善紫色土的土壤质量和实现土壤可持续发展也具有重要的意义。

1材料与方法

1.1 试验设计

国家紫色土土壤肥力与肥料效益监测基地于1991年在重庆市北碚区建立，迄今已开展了25年连续定位试验，试验点位于重庆市北碚区西南大学教学农场，试验地地处东经106°26′，北纬30°26′，年平均气温18.4℃，全年降水1 105.5 mm、日照1 276.7 h，气候为亚热带季风气候。供试土壤为中性紫色水稻土，由侏罗纪沙溪庙组紫色砂、页岩的坡积物和残积物母质发育而成的紫色土(类)、中性紫色土亚类、灰棕紫泥土属经水耕熟化过程而形成。

本研究涉及其中9个处理：①CK(无肥区)；②N；③NP；④NK；⑤NPK；⑥M；⑦NPK+M；⑧1.5NPK+M；⑨(NPK)Cl+M。M代表猪粪尿，处理8为化肥增量区，氮、磷、钾肥用量是其它各处理的1.5倍，处理9为含氯化肥试验区，氮、钾肥用氯化铵、氯化钾；其它各处理氮、钾肥分别用尿素、硫酸钾；磷肥用过磷酸钙。其中每种肥料的施用量为：氮肥150 kg·hm-2；磷肥60 kg·hm-2；钾肥60 kg·hm-2；有机肥22.5 t·hm-2，其水分含量为89%，N、P、K养分干基含量分别为0.48%、0.26%和0.77%。试验地采用小麦-水稻轮作，小区面积120 m2，小区之间用40 cm深的水泥板隔开，互不渗漏，且能独立排灌。

1.2 样品采集

于2016年10月水稻收割后进行田间取样，用土钻钻取0～20 cm的耕作层土样，混匀，挑去肉眼可见细根后过2 mm筛，放入-20℃的冰箱保存以备后续分析。部分放入冰箱于4℃保存，立即进行硝化细菌数量、氨氧化潜势及硝化强度的测定，另取一部分放于室内风干供基本理化分析用。供试土壤基本理化性质见表1。

表1 供试土壤的基本性质

1.3 测定项目及方法

土壤pH值用酸度计法[13]，有机碳用重铬酸钾容量法，全氮用半微量凯氏法，全磷用氢氧化钠碱熔-钼锑抗比色法，全钾用氢氧化钠碱熔-火焰光度法，有效磷用Olsen法，速效钾用醋酸铵浸提-火焰光度法[14]。

土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌amoA基因的Real-time PCR分析：称取0.5 g鲜土，用土壤Fast DNA©SPIN Kit(QBIO gene Inc.,Carlsbad,CA,USA)提取不同处理土壤微生物总DNA，提取过程按试剂盒说明书进行。用iQ5(Bio-rad,USA)荧光定量PCR仪，通过SYBR Green法来测定氨氧化细菌和氨氧化古菌amoA基因的丰度，amoA基因的扩增用SYBR©Premix Ex TaqTM(TaKara Bio,Otsu,Shiga,Japan)，氨氧化细菌和氨氧化古菌的amoA基因扩增引物分别为amoA-1F/amoA-2R、Arch-amoAF/Arch-amoAR[15-17]，PCR扩增反应体系为25 μL，引物序列及反应程序参见表2。Real-time PCR反应完成后设置溶解曲线用以检验产物的特异性，其程序为 55～99℃之间，起始模板浓度由 Ct 值确定。数据分析采用 iCycler 软件(version 1.0.1384.0 CR)。标准质粒拷贝数的对数值作为纵坐标，不同浓度质粒的 Ct值作为横坐标，建立标准曲线[18]。

表2 PCR引物和反应程序

硝化细菌的测数采用稀释频度法(most probable numble method,MPN法)[19];氨氧化潜势的测定参考Kurola等[20]的方法；硝化强度的测定采用悬液培养法[21]。

1.4 数据处理

所有数据均采用Excel 2003和SPSS 18.0统计软件进行统计分析，S-N-K 检验计算显著性差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同施肥对紫色土硝化微生物的影响

2.1.1 不同施肥紫色土氨氧化细菌与氨氧化古菌丰度分析

Real-time PCR的结果如表3所示。可以看出，不同施肥处理土壤中氨氧化细菌amoA基因拷贝数变化较大，每克干土拷贝数(4.46×103～5.41×105)的log值在3.65～5.73之间，单施化肥或化肥与有机肥配合施用均显著提高该土壤氨氧化细菌丰度，1.5NPK+M处理最高，为CK处理的121倍，而单施有机肥处理土壤氨氧化细菌丰度与CK处理相比差异不显著。施用磷肥处理(NP、NPK+M、1.5NPK+M)土壤氨氧化细菌丰度显著高于未施磷处理(N、NK、M)，NPK处理也高于未施磷处理，说明磷素营养是影响氨氧化细菌生长重要的因素之一。(NPK)Cl+M处理土壤氨氧化细菌丰度对数值为5.41，显著低于NPK+M和1.5NPK+M处理的5.62和5.73，可推测含氯化肥的施用会在一定程度上抑制氨氧化细菌生长。

表3 不同施肥处理对氨氧化细菌与氨氧化古菌amoA基因拷贝数的影响(Log) (g-1干土)

注：不同小写字母分别表示处理间差异达5%显著水平。

依据标准曲线用Real-time PCR技术获得的不同施肥处理氨氧化古菌aomA基因拷贝数变化较小，结果如表3所示。NP处理每克干土aomA基因拷贝数最高达1.38×107(Log值为7.14)，(NPK)Cl+M处理每克干土aomA基因拷贝数最低为1.64×106(Log值为6.21)，除施用NP显著提高了土壤氨氧化古菌丰度外，其他施肥处理土壤氨氧化古菌aomA基因拷贝数差异不显著，说明施肥对该土壤氨氧化古菌丰度的影响较小。

2.1.2 不同施肥紫色土硝化细菌数量的变化

由图1可知，施肥影响了硝化细菌的数量。土壤硝化细菌数量变化幅度较大，呈0.39×102～7.28×103个·g-1干土变化。与CK相比，单施化肥或化肥与有机肥配合施用均显著提高该土壤硝化细菌数量，以1.5NPK+M处理硝化细菌数量最高，达7.28×103个·g-1干土,NPK+M处理次之，为2.91×103个·g-1干土，NP、NK、NPK和N处理之间差异不显著，但(NPK)Cl+M处理显著低于以上施肥处理，M处理最低且与CK相比无显著性差异。

图1 不同施肥处理土壤硝化细菌数量的变化

2.2 不同施肥对紫色土硝化特征的影响

2.2.1 不同施肥紫色土氨氧化潜势的变化

氨氧化(也称亚硝化)作用是硝化作用的第一个过程，氨氧化潜势也称硝化速率，可以用来表征土壤氨氧化能力[20]。由图2可以看出，施肥明显影响了该土壤氨氧化潜势变化，NPK+M处理土壤氨氧化潜势最高，为0.310 μg·g-1·h-1干土，其次分别为NPK、NP、M处理，以上处理与CK处理的土壤氨氧化潜势0.157 μg·g-1·h-1干土相比，均显著提高了土壤氨氧化潜势，提高量分别为97.5%、82.8%、67.5%、56.7%和41.8%。N和NK对土壤氨氧化潜势无明显影响，而(NPK)Cl+M显著降低了土壤氨氧化潜势，相较CK降低了81.5%。由此可见，施用磷肥处理土壤氨氧化能力相对较高，而含氯化肥的施用极大抑制了土壤氨氧化能力，不同施肥处理土壤氨氧化潜势与土壤氨氧化细菌amoA基因拷贝数(表3)变化较一致。

2.2.2 不同施肥紫色土硝化强度的变化

亚硝酸氧化作用是硝化作用的第二个过程，亚硝酸氧化细菌将NH4+-N 氧化成NO3--N 的作用可以用硝化强度表示。由图2可以看出，不同施肥制度对土壤硝化作用强度有明显的影响，硝化强度的变幅在25%～59%之间。与土壤氨氧化潜势变化类似，相较于CK处理的土壤硝化强度(32%)，除(NPK)Cl+M处理外，所有施肥处理土壤硝化强度均得到显著提高。NPK+M处理硝化强度最高，为59%，1.5NPK+M 、M 、NPK、NP处理相接近，在43%～53%，N与NK处理无显著差异，分别为38%和39%，(NPK)Cl+M显著降低了土壤硝化强度，为25%。施肥对土壤硝化强度的影响与土壤硝化细菌的数量(图1)变化不一致。

图2 不同施肥处理土壤氨氧化潜势与硝化强度的变化

3 讨论

3.1 不同施肥对紫色土氨氧化菌amoA基因与硝化细菌数的影响

在本试验条件下氨氧化古菌amoA基因拷贝数要远远高于氨氧化细菌，其比值范围为6.37～657.72。在每克干土中高达1.38×108，这一结果与许多土壤环境研究中得到氨氧化古菌amoA基因高拷贝数相一致[22-23]，不过在农田土壤中，虽然AOA在数量上占绝对优势，但氨氧化过程却仍主要由AOB完成[24]。

研究结果表明，土壤AOB丰度受到了长期不同施肥管理措施的影响。施用氮肥显著提高了土壤AOB丰度(表1)，这是由于氮肥为AOB提供了直接可利用的氮源[25]，在以往的研究中也得到类似的结果[10]。同时，值得注意的是施用磷肥处理土壤AOB均高于对应的不施磷肥处理，在他人研究中也发现AOB丰度与土壤速效磷呈正相关[26]，表明磷在一定意义上也促进了氮循环功能微生物的生长[27]。目前关于磷肥对土壤功能微生物的影响的研究较少，需要加强此类的研究。(NPK)Cl+M处理土壤AOB丰度显著低于其他施肥处理，一方面这可能与含氯化肥的施用降低了土壤pH值(表1)有关，由于AOB适宜生长的酸度范围为pH值7.0～8.5，一般在pH值小于6.5的环境中不易生长[28]，基于不同pH值的紫色土的研究也表明，酸性紫色土中AOB和AOA的丰度低于中性和石灰性紫色土[29]；另一方面可能是Cl-本身对AOB形成了毒害作用所致[30]。

结果还表明，相对于对AOB丰度的影响，长期不同定位施肥对AOA丰度的影响较小，这可能是本试验研究采用的是中性紫色土，与其他研究中所采用的酸性土或者碱性土有所差别。因此，施肥对土壤氨氧化微生物丰度的影响非常复杂，可能与肥料的种类、施肥方式、土壤类型和利用方式等因素有关[12]。

施肥能显著提高该土壤硝化细菌数量(图1)。有机无机肥配施对比单施无机肥显著增加了土壤硝化细菌数量，1.5NPK+M处理硝化细菌的数量最高，是由于长期向土壤中投入高量化肥和有机肥为硝化细菌提供了更多可利用的无机营养物质以及碳源所致[31]；而单施有机肥硝化细菌数量与长期无肥处理无显著性差异，源于化能自养型硝化细菌是硝化反应的主要作用者，不利用有机碳化合物作为碳源和能源，有机质甚至可能会抑制硝化细菌生长[31]。(NPK)Cl+M处理硝化细菌数量相对较低，这可能与土壤pH值有关，一般认为土壤硝化细菌生长最适pH值范围在8.5左右，该处理土壤pH值为5.6时对土壤硝化细菌的影响相对于为硝化细菌提供营养物质这一因素显得更为突出。

3.2 不同施肥对紫色土氨氧化潜势和硝化强度的影响

硝化作用是由土壤微生物主导的作物氮素营养的重要环节，施肥是调控土壤微生物硝化作用的手段[32]。同施肥对土壤氨氧化细菌丰度的影响类似，氮肥、磷肥均对土壤氨氧化潜势有显著的提高作用，有机无机肥配施显著提高了土壤氨氧化潜势，表明了农田土壤中氨氧化过程仍由氨氧化细菌主导[24,33]。不同施肥处理土壤硝化强度的变化与氨氧化潜势变化表现出相同的趋势，表明了土壤硝化过程中氨氧化过程是主要的限速步骤[34]。但同时发现长期不同施肥下硝化细菌数与土壤氨氧化潜势及土壤硝化强度变化并不一致，有研究认为硝化细菌数量与土壤硝化强度无显著相关关系[35-36]，本试验也证实了这一结果。另外，含氯化肥的施用导致其土壤氨氧化潜势与硝化强度显著低于其它处理，源于长期施用含氯化肥导致土壤酸化，而pH值影响着土壤NH3的存在形态，低pH值时氨分子会转为NH4+，底物浓度的变化影响了氨氧化菌的丰度和多样性[37]，结果表现为低pH值抑制了土壤硝化强度[38]。

4 结论

在水旱轮作体系下的中性紫色土上，相较于对土壤氨氧化古菌丰度的影响，长期施肥对土壤中氨氧化细菌丰度的影响较大，施用氮肥及施用磷肥都显著提高了氨氧化细菌的丰度，单施有机肥对土壤氨氧化细菌丰度没有显著影响，而有机无机配施则可以显著改善土壤氨氧化微生物丰度。值得注意的是长期施用含氯肥料显著抑制了土壤氨氧化潜势与硝化强度。长期不同施肥下氨氧化潜势与硝化强度的变化较为一致，硝化强度与硝化细菌数量的变化不一致，因此不能用硝化细菌数量的多少表征紫色土的硝化强度。本研究表明，长期施肥，特别是有机无机肥配施能支持更大的土壤的氨氧化微生物群体，从而增加紫色土氨氧化潜势与硝化强度，对研究中性紫色土的氮循环具有重要意义。