国产两性霉素B及其他常用抗真菌药物对侵袭性真菌病病原菌的体外抑菌活性研究

周亚彬 王千 张浩 万喆 李若瑜 刘伟

(北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌与真菌病研究中心 皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034)

近年来，不断有新的侵袭性真菌病的致病菌种被发现，镰刀菌等少见真菌感染导致的侵袭性真菌病也在逐渐增加[1]。虽然近年来新型抗真菌药物不断问世，但其种类仍然较少，临床上治疗侵袭性真菌病仍然存在诸多困难[2]。两性霉素B(amphotericin B，AMB)是一个经典的广谱抗真菌药物，自1959年上市以来，一直在侵袭性真菌感染中发挥着重要治疗作用[3]。但有关该药的药效学，特别是对于国内近年来临床分离的病原真菌体外抗菌活性则缺乏最新的研究资料，影响了临床用药的选择。本研究采用国产AMB与当前临床常用的治疗侵袭性真菌感染的抗真菌药物进行比较，观察它们对我国临床分离的念珠菌、隐球菌、曲霉、毛孢子菌、赛多孢菌、毛霉等病原真菌的体外抗菌活性。同时还将侧重于观察AMB对于唑类药物耐药的曲霉和念珠菌的体外抗菌活性，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 受试菌

108株受试菌株系北京大学第一医院皮肤性病科真菌室、北京大学真菌和真菌病研究中心保藏菌株，分离自临床侵袭性真菌病患者，其中包括念珠菌41株 (白念珠菌15株、近平滑念珠菌5株、热带念珠菌4株、光滑念珠菌5株、克柔念珠菌1株、西木龙念珠菌4株、葡萄牙念珠菌3株、季也蒙念珠菌3株、解脂念珠菌1株)，曲霉菌38株 (烟曲霉15株、黄曲霉8株、构巢曲霉5株、黑曲霉5株、土曲霉5株)，隐球菌7株 (新型隐球菌5株、罗伦隐球菌2株)，毛孢子菌4株 (阿萨希毛孢子菌3株、Trichosporonloubieri1株)，赛多孢菌4株 (多育赛多孢菌1株，尖端赛多孢菌3株)，毛霉9株 (不规则毛霉2株、卷枝毛霉1株、冻土毛霉1株、伞枝横梗霉1株、米根霉3株、小孢根霉1株)，茄病镰刀菌2株，马尔尼菲篮状菌3株。克柔念珠菌 (ATCC 6258)、近平滑念珠菌 (ATCC 22019)、黄曲霉 (ATCC 204304) 为药敏试验用质控菌株。

1.2 受试药物

所有药物均以原料粉形式提供，AMB由华北制药集团有限责任公司提供，批号YAN1607201，纯度96.3%；氟康唑 (fluconazole，FLC)由Sigma-Aldrich公司提供，批号200606040，纯度为98.93%；伊曲康唑 (itraconazole，ITR)由华中海威基因科技有限公司提供，批号6122910188，纯度99%以上；伏立康唑 (voriconazole，VRC)由山东省寿光富康制药公司提供，批号070724，纯度99.3℅；泊沙康唑 (posaconazole，POS)由华中海威基因科技有限公司提供，批号6502P126，纯度99%以上；卡泊芬净 (caspofungin，CAS)由华中海威基因科技有限公司提供，批号61205C0120，纯度99%以上；米卡芬净 (micafungin，MCF)由华中海威基因科技有限公司提供，批号1026B410，纯度99%以上。

1.3 体外抑菌活性测定

方法 酵母菌和丝状真菌的最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration，MIC)或最低有效浓度 (minimum effect concentration,MEC)测定，分别参照美国临床和实验室标准协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的M27-A3[4]和M38-A2[5]方案进行。

培养基选择 按照CLSI方案要求采用RPMI-1640液体培养基。

药物储存液制备与储存 抗真菌药物按照溶解性分别采用二甲基亚砜 (DMSO)或蒸馏水溶解，获得相应浓度 (包括各药物的折点和质控菌株对该药物MIC范围)的储存液。新鲜配制的储存液分装到无菌的聚丙乙烯小管，密封储存于-70℃。

药敏板配置 实验前采用相应液体培养基稀释至2倍终浓度工作液。ITR、VRC、POS、AMB、CAS、MCF最终浓度范围为0.03～16 mg/L，FLC最终浓度范围为0.125～64 mg/L。将稀释的药物按照浓度由高到低依次加入微量药敏板 (96孔酶标板)1～10列中，每孔100 μL，第11、12列分别加入100、200 μL相应液体培养基 (药物采用DMSO稀释者含同浓度的DMSO)，分别作为生长对照和空白对照，-20℃保存备用。

菌悬液制备及接种 将受试酵母菌分离株转种于马铃薯葡萄糖琼脂 (potato dextrose agar，PDA)培养基上35℃培养生长24～72 h，双相真菌马尔尼菲篮状菌采用致病相酵母相进行药敏试验，参考文献[6-7]，转种于脑心浸液琼脂 (brain heart infusion，BHI)培养基上，37℃培养，每7 d传代1次，直至70%以上细胞转化为酵母样细胞。用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落，制成菌悬液，使用比浊仪调整菌悬液浓度至 (1～5)×106CFU/mL，先用液体培养基稀释菌液20倍，再稀释50倍其菌含量为 (1～5)×103CFU/mL，对于马尔尼菲篮状菌用液体培养基稀释菌液100倍其菌含量为 (1～5)×104CFU/mL。在96 孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最终菌浓度为 (0.5～2.5)×103CFU/mL，对于马尔尼菲篮状菌最终菌浓度为 (0.5～2.5)×104CFU/mL。丝状真菌菌株转种于PDA培养基上，35℃培养生长2～7 d。用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落 (曲霉菌制备菌悬液时可加入1%吐温-20)，制成菌悬液，使用比浊仪调整菌悬液浓度至 (1～5)×106CFU/mL，再用液体培养基稀释菌液50倍其菌含量为 (2～10)×104CFU/mL。在96孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最终菌浓度为 (1～5)×104CFU/mL。

孵育与结果判读 将接种后的药敏培养板培养一定时间后 (酵母菌置于35℃恒温培养24～72 h，丝状真菌置于35℃恒温培养21～74 h，马尔尼菲篮状菌置于37℃恒温培养72 h)，观察结果。按照CLSI制定的标准进行结果判读，读取MIC或MEC值。只有当生长对照生长良好且质控菌株MIC/MEC值在规定范围内时，方认为试验成功，可进行结果判读。所有试验均做2次，同一菌株MIC/MEC值在2次试验不超过2个稀释度时认为相同。FLC、VRC、CAS和MCF对念珠菌的折点为M27方案的补充材料S4制定的折点[8]，其余菌株与药物无相应折点，仅判读MIC或MEC值。

2 结 果

因菌株数不足5株时，无法计算GM、MIC/MEC50及MIC/MEC90，故只统计MIC/MEC范围。AMB及其他6种抗真菌药物对108株侵袭性真菌病致病菌的MIC/MEC值结果见表1 (菌株数≥5株)及表2 (菌株数<5株)。

表17种抗真菌药对侵袭性真菌病致病菌的MIC/MEC及GM (mg/L)

Tab.1MIC/MEC&GM values of seven antifungal agents against isolates caused invasive fungal infection

菌种数目药物MIC/MEC范围50%90%GM白念珠菌15AMB0.5-1110.912FLC0.125->6416>643.647ITR0.06-20.520.455VRC0.03-0.50.030.50.064POS0.03-0.1250.060.060.048CAS0.06-0.250.1250.250.164MCF0.03-0.250.030.030.035近平滑念珠菌5AMB1111FLC0.125-0.50.250.50.25ITR0.25-10.510.5VRC0.030.030.030.03POS0.03-0.1250.030.1250.046CAS0.125-20.2520.435MCF1111光滑念珠菌5AMB0.5-1110.871FLC16->6432>6427.858ITR0.5-4141.516VRC0.06-20.0620.212POS0.03-0.50.250.50.216CAS0.125-0.250.250.250.218MCF0.030.030.030.03新生隐球菌5AMB0.25-20.520.66FLC1-4242.297ITR0.25-10.510.435VRC0.03-0.1250.060.1250.053POS0.125-10.2510.287CAS16->1616>16>16MCF16->16>16>16>16烟曲霉15AMB1-2121.382FLC>64>64>64>64ITR0.5->161>162VRC0.5->16120.955POS0.125->160.2510.315CAS0.03-0.1250.060.1250.050MCF0.030.030.030.03

黄曲霉8AMB1-2221.542FLC>64>64>64>64ITR0.25-40.540.648VRC0.125-8180.841POS0.25-0.50.250.50.273CAS0.03-10.510.207MCF0.030.030.030.03黑曲霉5AMB0.125-10.510.379FLC>64>64>64>64ITR1-2121.149VRC0.25-2120.66POS0.06-0.250.1250.250.142CAS0.03-0.1250.060.1250.060MCF0.030.030.030.03土曲霉5AMB2-4242.297FLC>64>64>64>64ITR0.5-1110.871VRC0.125-0.50.250.50.25POS0.125-0.250.1250.250.165CAS0.06-0.1250.1250.1250.093MCF0.030.030.030.03构巢曲霉5AMB1-2121.149FLC>64>64>64>64ITR1-2121.149VRC0.25-2120.66POS0.06-0.250.1250.250.142CAS0.030.030.030.03MCF0.030.030.030.03

由表1可以看出AMB对受测的白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉等的MIC值均≤2 mg/L，但对土曲霉的MIC值范围为2～4 mg/L。同时AMB对耐唑类药物的白念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉及黄曲霉MIC值均≤2 mg/L；FLC对白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌的MIC值范围分别为0.125～>6、0.125～0.5、16～>64、1～4 mg/L。FLC对受试的曲霉MIC值均>64 mg/L。ITR对白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉的MIC值范围分别为0.06～2、0.25～1、0.5～4、0.25～1、0.5～>16、0.25～4、1～2、0.5～1、1～2 mg/L；VRC对白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉的MIC值范围分别为0.03～0.5、0.03、0.06～2、0.03～0.125、0.5～>16、0.125～8、0.25～2、0.125～0.5、0.25～2 mg/L；POS对白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉的MIC值范围分别为0.03～0.125、0.03～0.125、0.03～0.5、0.125～1、0.125～>16、0.25～0.5、0.25～2、0.125～0.25、0.06～0.25 mg/L；CAS对白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉的MIC值范围分别为0.06～0.25、0.125～2、0.125～0.25、0.03～0.125、0.03～1、0.03～0.125、0.06～0.125、0.03 mg/L；MCF对白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌的MIC值范围分别为0.03～0.25、1、0.03 mg/L。MCF对受测的曲霉MEC值均为0.03 mg/L。CAS和MCF对新生隐球菌MIC值均≥16 mg/L。

由表2可以看出AMB对受测的热带念珠菌、希木龙念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌、克柔念珠菌、解脂念珠菌、罗伦隐球菌、毛孢子菌、马尔尼菲篮状菌、茄病镰刀菌、毛霉的MIC值均≤2 mg/L，但对多育赛多孢、尖端赛多孢的MIC值分别为>16 mg/L、1～8 mg/L；FLC对受测的茄病镰刀菌、赛多孢菌、毛霉的MIC值均>64 mg/L；ITR对茄病镰刀菌、多育赛多孢、卷枝毛霉等MIC值分别为8 mg/L、>16 mg/L、>16 mg/L；VRC对受测的茄病镰刀菌、多育赛多孢及毛霉的MIC值均≥16 mg/L；POS对茄病镰刀菌、多育赛多孢、卷枝毛霉等的MIC值均>16 mg/L；MCF和CAS对毛孢子菌、茄病镰刀菌、毛霉及尖端赛多孢菌的MIC或MEC值均≥16 mg/L，对多育赛多孢菌抑菌的MEC值分别为8 mg/L和4 mg/L。

3 讨 论

本研究显示AMB对受试的几乎所有侵袭性真菌病的致病菌都有良好的抑菌活性，提示AMB适用于治疗侵袭性真菌病。但由于土曲霉对AMB天然耐药，AMB并不适用于治疗土曲霉感染[9]。同时AMB对赛多孢菌的抑菌活性亦较差，提示AMB并不适用于治疗赛多孢菌感染。

表2 7种抗真菌药对侵袭性真菌病致病菌的MIC/MEC (mg/L)

念珠菌和曲霉 (土曲霉除外)对AMB具有良好的敏感性，并且耐唑类药物的念珠菌和曲霉对AMB仍然具有均有良好的敏感性，提示AMB适用于治疗念珠菌和曲霉感染，特别是对耐唑类药物的念珠菌和曲霉的感染。FLC、ITR、VRC对部分念珠菌的MIC值较高，提示临床用药时需考虑耐药的问题。POS对念珠菌的MIC值均≤0.5 mg/L，提示POS比较适用于治疗念珠菌感染。ITR、VRC和POS对部分曲霉的MIC值较高，提示临床用药时需考虑耐药的问题。CAS和MCF对念珠菌和曲霉的MIC/MEC值均较低，提示棘白菌素药物适用于治疗念珠菌和曲霉感染。

隐球菌和毛孢子菌对AMB和唑类药物的敏感性较好，但对棘白菌素药物CAS与MCF敏感性很差，与既往的Fera MT、Montoya AM、Tomazin R等[10-12]研究结果一致。提示AMB与唑类药物适用于治疗隐球菌和毛孢子菌感染。

马尔尼菲篮状菌对AMB、唑类药物和棘白菌素药物的敏感性均较好，提示这三类药物均适用于治疗马尔尼菲篮状菌感染。而受测的所有丝状真菌对FLC的敏感性很差，提示FLC不适用与治疗丝状真菌导致的侵袭性真菌病。

茄病镰刀菌对AMB的敏感性较好，但对唑类药物、棘白菌素药物的敏感性较差，与既往Gupta C等[13]研究结果一致。提示临床对于茄病镰刀菌感染可采用的药物有限，而AMB是较合适的药物。本研究还显示多育赛多孢菌对AMB、唑类药物和棘白菌素药物均不敏感，而尖端赛多孢菌对这些药物的敏感性亦相对较差，与既往Homa M等[14]的研究结果一致。对于这种情况，有学者认为多种抗真菌药物联合治疗或许是比较适合的治疗赛多孢菌感染的方式[15]。

毛霉菌对FLU、VRC、CAS、MCF的敏感性较差，而对AMB、ITR、POS的敏感性较好，与既往Drogari-Apiranthitou M、Vitale RG、Chowdhary A等[16-18]的研究结果一致。并且AMB对耐ITR和POS的卷枝毛霉仍有良好的抑菌活性，提示AMB是较适合的治疗毛霉感染的抗真菌药物。

本研究使用CLSI标准化药敏方案检测国产AMB和其他常用抗真菌药物对侵袭性真菌病致病菌的体外抗菌活性，结果显示同其他常用抗真菌药相比AMB对分离自中国的常见侵袭性真菌病的致病菌有良好的体外抗菌活性，但土曲霉和赛多孢菌除外。