两品系大鼠经皮电阻试验结果的比较

罗飞亚，冯克然，张露勇，胡培丽，邢书霞，王钢力

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

皮肤腐蚀性是化学品及化妆品安全管理中一项较为重要的毒理学终点，随着动物福利“3R”(减少Reduction、优化Refinement、替代Replacement)原则的提出，在毒理学安全性评价领域中，替代检测技术受到越来越多的关注[1-3]。OECD指南批准的皮肤腐蚀性替代试验仅有3类，包括大鼠经皮电阻试验(transcutaneous electrical resistance test method，TER)[4]，体外皮肤刺激性/腐蚀性的重组人表皮模型试验(RHE)[5-6]和体外皮肤腐蚀性膜屏障试验[7]。其中TER是利用大鼠背部离体皮肤检测腐蚀性，与传统的家兔试验相比[8]，TER减少动物数量、减轻动物痛苦，符合“3R”原则[9-10]。OECD指南中推荐使用Wistar大鼠或其他类似品系的大鼠，考虑SD大鼠是较为常用的研究皮肤病理相关的大鼠品系[11-12]，而SD大鼠又是由Wistar大鼠育种而来，但两种品系已存在遗传学差异[13]。因此，本研究通过对比SD大鼠与Wistar大鼠的经皮电阻腐蚀性测试结果，从而为大鼠经皮电阻测试选择合适的大鼠品系提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar种大鼠，鼠龄18～21 d，体重60～80 g；SPF级SD大鼠，鼠龄18～21 d，体重80～100 g，均由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供【SCXK(京)2014-0013】。动物试验环境条件为屏障环境【SYXK(京)2016-0004】，温度22℃～24℃，相对湿度50%～70%，动物自由饮食，日光灯12 h照明。大鼠皮肤应健康无破损，试验前动物在实验动物房环境中至少适应3 d后，剃去背部和两侧被毛，间隔3 d以含抗生素溶液浸洗去毛区2次。

1.2 试剂与仪器

选择《化妆品安全技术规范》(2015版)大鼠经皮电阻试验中推荐的12种参考物质作为受试物：4-氨基-1,2,4-三氮唑(TCI)、丁子香酚(国药集团北京分公司)、溴乙基苯(Alorich)、四氯乙烯(国药集团北京分公司)、异硬脂酸(Adamas)、4-甲硫基-苯甲醛(TIC)、N,N-二甲基亚二丙基三胺(Adamas)、邻叔丁基苯酚(TCI)、氢氧化钾(10% w/v，国药集团北京分公司)、硫酸(10% w/v，国药集团北京分公司)、辛酸(国药集团北京分公司)、1,2-丙二胺(国药集团北京分公司)。以盐酸(10 mol/L)作为阳性对照，去离子水作为阴性对照。电解液(154 nmol/L MgSO4)、罗丹明B染料(10% w/v SRB)、染料萃取液(30% w/v SDS)。

大鼠经皮电阻仪由北京华清天禧医药科技有限公司提供，仪器参数符合OECD指南及《化妆品安全技术规范》(2015版)[12]要求(工作电压220 V，50 Hz，交流电，工作电极为2根216惰性银电极)，皮肤固定装置选用聚四氟乙烯参照OECD指南装置示意图及尺寸要求制作[5,14]。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠经皮电阻仪24 h稳定性

分别选取同一只Wistar大鼠或SD大鼠(29 d)背部靠近脊柱两侧的皮肤，制成直径约20 mm的小皮片5～6块，连续观察24 h内分别选取不同时间点(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、20、22、23和24 h)，读取大鼠经皮电阻值(TER)，重复试验3次，统计结果。

1.3.2 大鼠经皮电阻试验

依照《化妆品安全技术规范》(2015版)[14]的描述(与OECD指南操作一致)，大鼠于第29天时处死(大鼠处死时间必须在第28～30天内)，剪取去毛区皮肤，剔除皮下脂肪，表皮面向上固定于聚四氟乙烯管上，剪去多余皮肤，以液体石蜡封口。试验前向管内加入1 mL电解液(154 mmol/L硫酸镁溶液)，接上电极测定TER值，大于20 kΩ者可用。

液体受试物原液150 μL直接加入管内皮片的表皮面；固体受试物先研磨成细粉，取约100 mg撒在皮片表面，再加150 μL去离子水润湿以增加受试物与表皮的接触。加样后室温静置24 h，以流水轻柔地冲洗皮片表皮面，用洗瓶向表皮面滴加足量70%的乙醇，5 s后去除乙醇，再以流水清洗。尽量除净受试物后，向管内加入1 mL电解液，接上电极测定TER值。记录TER值后，去除管中的电解液，肉眼检查并纪录皮片的损伤情况。

1.3.3 罗丹明B(SRB)染料渗透量测定

向管内皮片表皮面滴加150 μL罗丹明B染料(10% SRB水溶液)，室温静置2 h，以流水轻柔的冲洗管壁，去除多余的SRB，并将皮片取下，放入含8 mL双蒸水的离心管中震摇5 min，换干净的双蒸水重复清洗1次。将皮片放入5 mL萃取液(30% SDS水溶液)中，60℃水浴提取过夜，去除皮片，剩余提取液以1900 r/min离心8 min，取上清液1 mL加4 mL萃取液稀释至5 mL，测吸光度值(OD值为565 nm)。

1.3.4 结果判定标准方案

OECD判定程序[4]：按OECD TG430的判定程序，TER>5 kΩ为非腐蚀性(NC)；对于TER≤5 kΩ且肉眼观察皮片有明显损伤判为腐蚀性(C)；TER≤5 kΩ且肉眼观察皮片没有明显损伤的进行染料渗透量测定；染料渗透量大于或等于10 mol/L盐酸的为C，染料渗透量小于10 mol/L盐酸的为NC。

注：E1-3分别为3次24 h稳定性监测曲线。

《化妆品安全技术规范》[14]判定程序：TER>15 kΩ为NC，TER<5 kΩ且肉眼观察皮片有明显损伤判定为C；TER为5 ～15 kΩ且肉眼观察皮片未见明显损伤的，或3个平行样的TER值在界值(5、15 kΩ)上下波动的或肉眼可见皮片明显破损、变色、变硬等可疑情况，需进行染料渗透量测定，染料渗透量大于或等于10 mol/L盐酸的为C，染料渗透量小于10 mol/L盐酸的为NC。

为同时兼顾OECD和《化妆品安全技术规范》的判定程序，实际上在试验中，除TER>15 kΩ，且肉眼观察皮片无损伤的受试物组外，其余组别的皮片均进行了罗丹明B染色的步骤。

2 结果

2.1 大鼠经皮电阻仪24 h仪器稳定性结果

大鼠皮片TER值变化如图1所示，在皮片置于皮肤固定装置后，TER值呈降低趋势，24 h后稳定在20～30 kΩ。两种大鼠皮片TER值3次重复试验的变化趋势一致。

2.2 TER腐蚀性结果判定及真实性分析

采用TER方法对12种参考物质进行腐蚀性检测，综合考虑TER值、罗丹明B染料渗透量和肉眼观察皮片损伤结果，并分别用OECD指南[4]和我国《化妆品安全技术规范》[14]的判定标准进行判定，结果如表1和表2所示。Wistar和SD大鼠检测阴性对照(双蒸水)TER平均值分别为18.36 kΩ和24.35 kΩ，符合OECD指南和安全技术规范中的参考数据(10～25 kΩ)，阳性对照10 mol/L盐酸的TER平均值分别3.93 kΩ和3.81 kΩ，均略高于OECD指南和安全技术规范的参考数据(0.5～1.0 kΩ)。

以OECD指南判定标准的结果显示，N,N-二甲基亚二丙基三胺、10%氢氧化钾和辛酸在Wistar和SD大鼠的检测结果中均呈现假阴性；以《化妆品安全技术规范》的判定标准结果显示，4-甲硫基-苯甲醛以Wistar大鼠检测结果呈现假阳性，以SD大鼠检测结果呈现阴性。

2.3 两品系大鼠结果比较

将两品系大鼠用两种方案判定的结果进行方法真实性分析，并与这12种参考物质的实际皮肤腐蚀性数据[15]进行χ2检验对比(表3)，发现两品系大鼠使用OECD指南判定腐蚀性结果一致，灵敏性50%，特异性100%；两品系大鼠使用安全技术规范判定的结果中，以SD大鼠效能最高，特异性和敏感性均达到100%，Wistar大鼠灵敏性100%，特异性83.3%。两品系大鼠使用OECD指南和《化妆品安全技术规范》判定结果均无显著性差异(P>0.05)。

两品系大鼠对同一个物质腐蚀性判定的结果基本一致，除Wistar大鼠以安全技术规范方法判定4-甲硫基-苯甲醛为腐蚀性(假阳性)而SD大鼠判定为非腐蚀性外，其余物质的判定结论均一致。经对比，两品系大鼠采用同一种判定标准判定的腐蚀性结果没有显著的统计学差异(P>0.05)。实验过程中观察发现，Wistar大鼠的TER读数整体偏低，皮片初始的电阻值偏小，弃用的情况较多。综上，在本实验条件下，推荐使用SD大鼠进行经皮电阻试验。

表1 Wistar大鼠腐蚀性测试结果

注：1：C：腐蚀性；NC：非腐蚀性；各受试物经皮腐蚀性为UN GHS目录中基于体内数据判定的结果[15]。2：No：未观察到皮片损伤；Yes：观察到皮片损伤。Note.1:C: Corrosion; NC: None corrosion; the corrosion were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults[15].2: No：There is no obvious damage on skin disc; Yes：There is obvious damage on skin disc。

表2 SD大鼠腐蚀性测试结果

注：1：C：腐蚀性；NC：非腐蚀性；各受试物经皮腐蚀性为UN GHS目录中基于体内数据判定的结果[15]。2：No：未观察到皮片损伤；Yes：观察到皮片损伤。Note.1:C: Corrosion; NC: None corrosion; the corrosion were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults[15].2: No: There is no obvious damage on skin disc;Yes: There is obvious damage on skin disc。

表3 两品系大鼠经皮电阻试验结果各判定方案的真实性指标分析(n=6，%)

注*: 所有结果与各受试物参考腐蚀性数据[15]进行比对。

Note.*. All results compared with the reference corrosive parameters of the tested substance.

3 讨论

OECD指南[4]和《化妆品安全技术规范》[14]方法中对试验是否进行第二步罗丹明B染色步骤的要求略有不同：OECD是以5 kΩ为界值，只要检测获得的TER值大于5 kΩ，且肉眼观察皮片无损伤，则不需要经过染色直接判定为非腐蚀性；而安全技术规范中要求在TER值为5 ～15 kΩ且肉眼观察皮片未见明显损伤的，或3个平行样的TER值在界值(5、15 kΩ)上下波动的或肉眼可见皮片明显破损、变色、变硬等可疑情况，均需进行染色步骤的判定。本研究中，两品系大鼠均表现为使用化妆品安全技术规范判定时方法效能更高，说明进行罗丹明B染色可有效地提高对皮肤腐蚀性判定的准确性。

TER方法腐蚀性判定界值与研究所使用的大鼠经皮电阻仪性能相关[16]，不同的大鼠经皮电阻仪其判定界值可能会改变，这点与OECD指南[4]中指出的“如采用新的仪器检测，可能会改变判定界值，需要进一步验证”的描述一致。本研究中所使用的大鼠经皮电阻仪是配合《化妆品安全技术规范》方案设计，因此使用安全技术规范的方案判定效能更高。

OECD指南及《化妆品安全技术规范》中均推荐使用Wistar大鼠，但原文中也说可以使用其他类似品系的大鼠。SD大鼠自1925年由Wistar大鼠培育而成[13]，广泛应用于皮肤肿瘤、皮肤科药物、皮肤病理等方面的研究，结合本研究的数据认为，SD大鼠可代替Wistar大鼠进行TER检测，符合OECD指南及《化妆品安全技术规范》对动物品系的要求。