核桃青皮抑菌剂对葡萄病原真菌的抑制作用

尹向田 ，曲静，张子文 ，汤小宁 *

（1.山东省葡萄研究院，山东省葡萄栽培与精深加工工程技术研究中心，山东 济南 250100；2.济南文旅花木开发有限公司，山东 济南 250100）

目前，我国核桃栽培面积和产量均居世界首位，随着核桃种植面积地持续增加，核桃青皮污染日趋严重，这些青皮多数被倒在路旁、水沟边，随着雨水的冲刷，流进了江、河、湖泊、农田等，对水资源和动植物的生存造成极大危害[1]。核桃青皮含有多种生物碱、鞣质、多酚类、黄酮类、单宁类、香豆类、萜类、甾类和有机酸物质等多种生理活性成分，还含有挥发油、脂肪酸、核桃多糖、胡桃醌及其衍生物等化学成分，具有一定的植物源农药活性。外皮中还含有较多的钾元素，在医学、农业、色素提取等方面都有广泛的应用[2,3]。

在发展生态农业和绿色食品的今天，采用植物源杀菌剂在农作物病虫害防治中越来越受重视。相比化学杀菌剂，植物源抑菌剂兼具抑菌效果好和安全的特性。许牡丹等[4]用超声波辅助法提取的荠菜多糖对链格孢菌有良好的抑菌活性，张苓花等[5]采用豆蔻浸提液用于草莓保鲜，抑菌率达69%以上。天然植物抑菌剂在食品、化妆品领域研究较多，在防治葡萄病害方面研究较少。对于葡萄病害的控制，目前除了加强田间管理外，使用较多的还是波尔多液、多菌灵、百菌清、甲基托布津、甲霜灵等化学药剂[6,7]，利用核桃青皮中含有的活性物质对葡萄病原菌产生抑制作用的研究鲜见报道。而当前对核桃青皮的研究也主要集中在提取有效活性物质上，大多采用溶剂提取、减压蒸馏、冷浸和热回流等方法[8-10]，这些方法存在提取率低、能耗大等缺点，而对核桃青皮整体处理的研究和技术较少，将其资源化的实践更少。本研究以废弃的核桃青皮为原料，利用核桃青皮中含有种类较为丰富的对真菌具有抑菌活性的次生代谢物质，研发出植物源杀菌剂，并研究其在葡萄生产上的防控技术，实现了核桃青皮废弃物的资源化高效利用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄炭疽病菌（Gloeosporium fructigrum）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄枝枯病菌（Pestalotia menezesiana）、葡萄穗轴褐枯病菌（Alternaria viticola）、葡萄蔓枯病菌（Phomopsis viticola）、葡 萄溃 疡 病 菌（Botryosphaeria dothidea）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、粉红聚端孢（Trichothecium roseum）、 尖 镰 刀 病 菌（Fusarium oxysporum）于山东省葡萄研究院良种与栽培研究室保存。

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L。

1.1.3 材料与试剂

核桃采自山东省济南市仲宫镇核桃园村，试验于2016年8月～2017年12月在山东省葡萄研究院进行。

硼酸硫酸锌，分析纯，购自于国药化学试剂有限公司，多宁77%硫酸铜钙可湿性粉剂，购自于江苏龙灯化学有限公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃青皮抑菌剂制备

将未使用乙烯利催熟剂脱皮的核桃鲜青皮使用榨汁机进行破碎、过滤后取清汁，进行真空浓缩5倍备用，浓缩压力为0.08 MPa，温度为75℃。浓缩后每1 L清汁中加入0.5 g硼酸和2.5 g硫酸锌。

1.2.2 核桃青皮抑菌剂对指示真菌的抑制作用

采用菌丝生长速率法：将核桃鲜青皮抑菌剂与PDA培养基分别按1:5、1:10、1:50体积比混合，制作PDA平板，在平板中央接d=0.5 cm的指示菌菌碟，以未加抑菌剂的PDA培养基平板为对照，25℃下培养，每个处理重复3次，5 d后计算抑菌率，抑菌率的计算公式见式（1）。挑取处理及对照的病原菌菌丝，在光学显微镜下观察无菌发酵液对菌丝形态的影响并进行拍照。

1.2.3 菌株GSBM05对葡萄白腐病的防治作用

选取健康的葡萄叶片，先用自来水冲洗干净，再用75%酒精消毒，晾干后将叶片放入铺有无菌滤纸的直径为100 mm的培养皿中，加入无菌水保湿，每个处理叶片10片，重复3次。取葡萄白腐病菌的孢子悬浮液与核桃青皮抑菌剂10倍液等体积加入到离心管中混匀得到接种液，以市面上常用的多宁可湿性粉剂800倍液及无菌水作为对照。用消毒接种针在每个叶片刺伤4～5个伤口，在伤口处分别接种50 μL接种液，28℃保湿培养，每天进行病害统计并计算防治效果，计算公式见式（2）（3）。叶片病害分级方法：0级：无病斑；1级：病斑面积占整片叶面积的5%以下；3级：病斑面积占整片叶面积的6%～15%以下；5级：病斑面积占整片叶面积的16%～25%以下；7级：病斑面积占整片叶面积的26%～50%以下；9级：病斑面积占整片叶面积的50%以上。

1.2.4 核桃青皮抑菌剂抑菌谱的测定

采用菌丝生长法，核桃青皮抑菌剂与PDA混合稀释10倍测定其对10种供试病原菌的抑制作用，计算抑菌率。

2 结果与分析

2.1 核桃青皮抑菌剂对葡萄白腐病菌的抑制作用

核桃青皮汁对葡萄白腐病菌的菌丝生长有强烈的抑制作用，并且抑制效果与浓度呈正相关。稀释5倍、10倍、50倍的核桃青皮抑菌剂对白腐病菌的抑制率分别为100%、78.1%、50.8%。纯浓缩汁的抑制率为70.1%。分别挑取对照和处理菌落边缘菌丝置于显微镜下观察，结果见图2，发现经处理后的菌丝严重畸形，菌丝断裂、顶端膨大成球形，有的菌丝呈念珠状。对照处理的菌丝生长正常，有明显的分隔，无畸形现象。

图1 核桃青皮抑菌剂对葡萄白腐病菌的抑制作用Fig.1 The inhibiting effect of antimicrobial agent of green walnut husk against grape white rot

2.2 核桃青皮抑菌剂对葡萄白腐病菌的防治效果

施药后接种病原菌的3个处理中，核桃青皮抑菌剂10倍液和多宁800倍液的防治效果较好，发病率和防效分别为9.4%、94.6%和3.2%、96.7%。青皮汁的防治效果低于核桃青皮抑菌剂，但防治效果也在85%以上，可见，青皮汁本身对葡萄白腐病菌就有较好的防治效果，在经过处理制成核桃青皮抑菌剂之后，防治效果更明显。

图2 核桃青皮抑菌剂处理后葡萄白腐病菌菌丝生长情况Fig.2 The growth of the mycelium of grape white rot treated with antimicrobial agent of green walnut husk

表2 核桃青皮抑菌剂对葡萄离体果实白腐病的防治效果Table 2 The control effect of antimicrobial agent of green walnut husk against on vitro grape fruit

2.3 核桃青皮抑菌剂抑菌谱测定

测定结果表明，核桃青皮抑菌剂稀释10倍后对10种供试植物病原真菌具有不同的抑菌活性，具体见表3。其中，对葡萄白腐病菌和粉红聚端孢的抑菌活性最强，分别为99.2%和100%。其次对葡萄灰霉病菌和立枯丝核菌的抑菌率也较强，均为88%以上，对葡萄枝枯病菌和葡萄炭疽病菌的抑菌率较差，分别为10.1%、34.9%。对其它病原菌的抑菌率在53.4%～72.3%之间。

表3 核桃青皮抑菌剂抑菌谱测定Table 3 Antagonistic activity of antimicrobial agent of green walnut husk against fungi direction

3 讨论

本研究研制成核桃青皮抑菌剂中，硼、锌是葡萄生长的重要元素，具有营养作用，还具备抑菌的作用。罗锦等[11]研究表明，外源硼酸对柑橘采后病害有良好的防治效果，周毅等[12]发现，硫酸锌处理后能刺激玉米种子中物质转化，促进养分积累。核桃青皮抑菌剂制备中选用的螯合剂为亚氨基二琥珀酸四钠IDS，它是新近出现的新型氨基酸基螯合剂，与EDTA、DTPA和NTA等同属氨基多羧酸类螯合剂的替代产品，环保高效，易溶于水，易吸收，无拮抗作用，是一种新型绿色环保的络合剂[13]。

本试验制备的核桃青皮抑菌剂对葡萄白腐病菌等多种葡萄相关的病原菌均具有良好的抑制作用，这在国内研究尚属首次。核桃青皮抑菌剂的研制不仅合理有效的解决了核桃青皮对环境的污染，变废为宝，保护和改善了农业生态环境，获得了生态效益，而且还开发出了高附加值的产品，有较高的经济效益。