不同培养温度下腐败希瓦氏菌模式菌株DSM6067差异蛋白质组分析

杨胜平，钱韻芳*，章 缜，程 颖，谢 晶*

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一种属于弧菌科（Vibrionaceae）希瓦氏菌属的革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，其对蛋白质具有较强的分解能力，并代谢产生硫化氢和胺类物质，是水产品等高蛋白食品中常见的一种特定腐败菌[1-3]。腐败希瓦氏菌常见于腐败的冷藏水产品中，可见其具有能够适应低温环境的遗传特性和低温应激调节功能，研究腐败希瓦氏菌等适冷微生物的低温适应机制能够为冷链流通中的水产品靶向抑菌保鲜技术的研发提供新的思路[4]。根据以往研究，利用形态学和生理生态学研究方法已经初步认识了微生物应对低温胁迫的代谢机制[5]，并分析了参与上述过程部分重要基因的功能[6-7]。然而，由于转录可变剪切、蛋白质翻译后修饰、蛋白质相互作用、蛋白质亚细胞定位等调控机制[8-9]，以及基因/蛋白质的多途径调控网络的存在，单纯基因组和转录组信息并不能全面揭示微生物适应低温的分子调控机制。另外，现阶段的研究对象也主要集中在海洋或极地细菌、单核细胞性李斯特菌等致病菌，而针对腐败希瓦氏菌的研究较少[10]。

蛋白质组学技术为深入分析生物胁迫生理研究提供了很好的技术平台[8,11]。目前蛋白质组学研究的主要方法主要包括双向电泳技术和基于液相色谱联合质谱分析的非凝胶技术。双向电泳技术是目前应用较广泛的蛋白质组学技术，Cacace等[12]采用该技术分析低温下单核细胞性李斯特菌的蛋白质组表达差异，从能量代谢等角度分析了单核细胞性李斯特菌的适冷机制；何伟娜等[13]也采用该技术初步对比了腐败希瓦氏菌净化水产品加工废水的生物学机制。该方法主要存在操作技能要求高、分离蛋白数量有限、歧视效应、与质谱联用差等诸多缺陷[14]。因此，基于液相色谱联合质谱分析的非凝胶技术发展迅速，在弥补双向电泳的技术缺陷方面显示了很好的实验效果[15]。

本研究采用Label-free蛋白质组学技术分析了30、10 ℃和4 ℃培养温度条件下腐败希瓦氏菌模式菌株蛋白质组差异表达情况，以期为探明腐败希瓦氏菌在低温胁迫下的分子调控机制提供数据支持，并为进一步探析腐败希瓦氏菌野生菌株适冷机制提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腐败希瓦氏菌模式菌株DSM6067 德国Leibniz-Institut DSMZ GmbH公司；Bradford蛋白质定量试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；脑心浸肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptone soy broth，TSB） 青岛海博生物技术有限公司；其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

离心机 美国Bio-Rad公司；SC210A热干浓缩仪、Ultimate 3000高效液相色谱仪、Q-Exactive HF质谱仪美国赛默飞世尔科技公司；Unico 2100分光光度计 美国Unico公司；Olympus BHS光学显微镜 日本奥林巴斯（中国）有限公司。

1.3 方法

腐败希瓦氏菌模式菌株DSM6067菌粉溶解于已灭菌的脑心浸肉汤中，于30 ℃活化培养12～18 h至菌液浓度达到108CFU/mL，取适量菌液接种于TSB中再次活化[16]。

1.3.2 菌种培养

吸取0.1 mL活化培养至108CFU/mL的TSB菌液于100 mL新鲜灭菌的TSB肉汤培养液中，分别在30 ℃（MS30）、10 ℃（MS10）、4 ℃（MS4）条件下培养至对数生长期中点（OD600nm约为0.6）。

1.3.3 蛋白质提取

取1 mL培养至对数生长期中点的菌体于离心管中，加入0.4 mL的蛋白裂解液（8.0 mol/L脲，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1×蛋白酶抑制剂），冰浴下超声破碎5 次，每次2 s。将超声破碎物冰浴20 min后在4 ℃条件下10 000×g离心30 min，取上清液于-80 ℃下保存待用。

1.3.4 蛋白质定量

根据Bradford蛋白质定量试剂盒的操作说明测定样品的蛋白质含量。

1.3.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

增加企业于市场竞争当中的整体优势是企业实行总体战略的最终追求目标，而价值优势与成本优势是企业市场竞争优势的主要体现领域，所谓价值优势，所指的是站在顾客的角度来看，企业需具有不同于其他竞争者的顾客价值；而成本优势所指的即为低成本经营，企业需获取与其他竞争者相较更低的价格方面优势。物流管理可为顾客提供更加个性化的服务，将可靠的服务与快速的反应能力作为企业的价值优势；且其可有效提升企业的资产周转率与生产能力利用率，使企业业务流程得到获得更好的整合与协作，为企业增加成本优势，提升企业市场竞争力。

各取25 μg蛋白质样品加入5×上样缓冲液，沸水浴5 min，于14 000×g离心10 min，取上清液，进行12.5% SDS-PAGE。电泳条件：恒流14 mA，电泳时间90 min。考马斯亮蓝染色。

1.3.6 蛋白Trypsin酶解

取20 μL超滤过的蛋白于离心管中，用50 mmol/L NH4HCO3溶液将尿素浓度稀释至2 mol/L，根据蛋白定量结果，按照蛋白和酶体积比100∶1加入Trypsin，37 ℃条件下酶解至少12 h。

1.3.7 高效液相色谱-质谱分析

每份样品采用纳升流速高效液相色谱系统Easy nLC进行分离。缓冲液：A液为0.1%甲酸溶液，B液为0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈体积分数为80%）。色谱柱以95%的A液平衡。样品由自动进样器上样到质谱预柱C18trap column（0.10 mm×20 mm，3 μm），再经分析柱C18column（0.15 mm×120 mm，1.9 μm）分离，流速为600 nL/min。相关液相色谱洗脱梯度如表1所示。

表1 液相色谱洗脱梯度参数Table 1 Mobile phase gradient parameters for HPLC analysis

每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长：90 min；检测方式：正离子；母离子扫描范围：m/z 300～1 400；一级质谱分辨率：m/z 300时120 000 次；AGC target：1×106；一级最大IT值：80 ms；扫描范围数目：1；动态排除：12 s。多肽和多肽的碎片的m/z按照下列方法采集：每次全扫描后采集10 个碎片图谱，二级质谱激活类型：更高能碰撞离解；隔离窗：m/z 1.6；二级质谱分辨率：m/z 120时15 000 次；微碎片图谱数：1；二级最大IT值：45 ms。

1.3.8 数据分析

质谱分析原始数据为RAW文件，将RAW文件通过软件Proteome Discoverer 1.4提交至Mascot服务器，进行查库鉴定及定量分析，查库使用Mascot软件版本为Mascot 2.2，数据库为txid24_8666s_160526.fasta。

1.3.9 生物信息学分析

用R语言编写的程序基于Gene Ontology（GO）（http://www.geneontology.org）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）（http://www.genome.jp/kegg/）的数据库的信息进行分析（北京邦菲生物科技有限公司）。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE分析

经蛋白质定量测定提取的MS30、MS10和MS4菌体总蛋白质量浓度分别为3.92、4.56 μg/μL和3.94 μg/μL，蛋白质含量较高。3 个样品的SDS-PAGE如图1所示，菌样蛋白在14～120 kDa区间内出现的条带非常密集，数量较多，相应的蛋白条带清晰，表明蛋白提取效果理想，样品纯度适于进行下一步二维液相色谱分级分离。

图1 腐败希瓦氏菌模式菌株DSM6067在不同温度下的SDS-PAGE图谱Fig. 1 SDS-PAGE patterns of total proteins from S. putrefaciens DSM6067 at different temperatures

2.2 蛋白质鉴定结果

3 组样品中鉴定到的蛋白种类数量如表2所示。MS30、MS10和MS4中鉴定得到的蛋白质条目数分别为1 739、1 761和1 832，表明随着培养温度的降低，腐败希瓦氏菌表达的蛋白质种类逐渐增多，且4 ℃下腐败希瓦氏菌表达的蛋白质种类较30 ℃多近100 个。

表2 蛋白质鉴定结果统计Table 2 Statistical results of protein identification

与腐败希瓦氏菌的最适生长温度（30 ℃）相比，腐败希瓦氏菌在10 ℃和4 ℃条件下蛋白质含量差异超过1.5 倍的差异蛋白表达情况如图2所示。与最适温度下培养的菌株（MS30）相比，MS4表达的差异蛋白共1 405 个，其中上调的蛋白有431 个，下调393 个，MS30与MS4相比检出或未检出的蛋白581 个，而MS10表达的差异蛋白有1 357 个，其中上调的蛋白有374 个，下调蛋白有420 个，有无蛋白563 个，表明温度越低，菌株的蛋白质组表达差异越明显。

图2 差异蛋白Venn图Fig. 2 Venn-diagram of numbers of differential proteins

2.3 GO功能注释分析

一级GO功能注释分析结果如图3所示，得到归类注释的蛋白涉及生物学过程、细胞组分及分子功能3个大类。以MS30为参照，MS10和MS4各差异蛋白在生物学过程分类中，占比最多的类别依次是代谢过程、氧化还原过程、转运和蛋白质水解。磷酸化类别在MS4中差异水平较MS10更显著，在生物学过程分类中排在第4位，而MS10的磷酸化类别只排到第13位。在细胞组分分类中，膜类别所占比例最多，其次为内在膜蛋白类别或细胞质类别。在分子功能分类中，排名前5 位的类别有核酸绑定类别、转移酶活性功能类别、ATP绑定类别、催化活性功能类别和金属离子绑定功能类别。

图3 差异蛋白GO功能注释分析Fig. 3 GO functional annotation analysis of differential proteins

图4 差异蛋白GO功能注释二级分析Fig. 4 Secondary GO functional analysis of differential proteins

如图4所示，与MS30相比，MS4和MS10发生变化的差异蛋白功能类似，以代谢过程类别、细胞过程类别、单组织过程类别为主，分子功能主要是催化活性和结合功能为主。

2.4 KEGG代谢通路分析

图5 差异蛋白KEGG注释Fig. 5 KEGG annotation of differential proteins

在生物体内，不同蛋白相互协调行使其生物学行为，基于通路的分析有助于更进一步了解其生物学功能。KEGG是有关通路的主要公共数据库[17]，通过通路分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。MS10和MS4与MS30相比较的差异蛋白KEGG代谢通路分析结果如图5所示。KEGG通路中的双组分系统是细菌中普遍存在和非常保守的一种重要调节机制，也是原核生物中重要的生理代谢调控系统[18]，其主要通过磷酸化和去磷酸化来实现信号传递。结果表明温度对双组分系统中的蛋白表达差异最为显著，且温度越低，差异越明显。此外，分析还发现两个比较组的差异蛋白主要是与碳代谢、氨基酸生物合成、丙酮酸代谢、糖代谢/糖质异生、三羧酸循环以及脂肪酸代谢等代谢信号通路相关。此外可看出，在参与脂肪酸代谢差异蛋白调控通路方面，4 ℃培养的腐败希瓦氏菌与30 ℃相比差异较为显著。

3 讨 论

本研究运用Label-free蛋白质组学技术对比研究了不同温度下腐败希瓦氏菌模式菌株DSM6067差异蛋白质组表达情况，共检测到蛋白质2 165 条，不同样品之间蛋白质数量上存在差异，且培养温度越低，腐败希瓦氏菌表达的蛋白质数量越多，这可能与腐败希瓦氏菌对低温的应激表达有关。通过GO注释分析发现，在细胞组分部分共涉及的14 个分类中，细胞和膜组分占比最高，说明参与腐败希瓦氏菌生理活动的分子组分主要集中于细胞内和细胞膜上。生物学过程部分中，代谢过程类别占比最高，其次为氧化还原过程、转运和蛋白质水解类别。KEGG代谢通路分析则发现差异蛋白主要涉及与能量代谢有关的碳代谢、丙酮酸代谢、糖代谢/糖异生、三羧酸循环等类别，说明腐败希瓦氏菌在低温应激条件下对蛋白质等营养物质的需求和消耗量增加，而Cacace等[12]也发现单核细胞性李斯特菌在低温下生长时能量代谢水平较最适温度下高。因此，推测提高基础代谢水平是微生物抵御低温环境、维持其生长活力的重要途径[19]。

本研究GO注释分析也证实低温下腐败希瓦氏菌差异蛋白质组中磷酸化类别和信号传导类别分别在生物学过程和分子功能中占比较高，与Cybulski等[20]研究发现低温下枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的膜蛋白磷酸化水平提高相一致，说明外界生长条件的改变会使得细胞的应答机制也要进行相应的调整，推测膜蛋白的磷酸化可降低低温信号传递至基因，激活特定基因的转录和翻译过程。该结果与KEGG代谢通路中双组分系统类别占主导相一致。

在分子功能部分中最具特征的是绑定分子功能类别所占比例最多，包括核酸绑定功能、ATP绑定功能、金属离子绑定、DNA绑定分子功能、RNA绑定分子功能等类别，表明绑定分子功能类别在腐败希瓦氏菌中显著的差异表达，其对于腐败希瓦氏菌在低温下的生理活动占有重要地位。有学者认为，低温可导致细菌DNA超螺旋结构的形成，使转录水平降低，而冷激蛋白可以与DNA、RNA等结合，保持其结构的稳定性，使复制和转录顺利进行[21-23]。另外，一些调控子、操纵子也可以与DNA、RNA结合，促进或抑制转录和翻译过程。ATP绑定功能则通常与转运和能量代谢有关[24]。

从KEGG代谢通路分析结果可知腐败希瓦氏菌的脂肪酸代谢活动也有一定增强。前人研究认为低温导致细胞膜磷脂双分子层脂肪酸凝固，膜流动性下降进而影响代谢[25-26]，而适冷菌之所以能够适应低温，与其能合成不饱和脂肪酸、短链脂肪酸、支链脂肪酸有关[27]。位于膜上的DesK和DesR被认为是脂肪酸脱氢酶基因的转录调控子[28]，DesK是一个在C末端含有组氨酸残基的组氨酸激酶，其可发生自磷酸化并催化DesR的磷酸化，最终将信号传导至基因[29-30]。

4 结 论

本研究发现腐败希瓦氏菌模式菌株DSM6067在不同温度环境下生长受到多基因网络体系的调控，各种信号

与代谢途径之间相互交错、彼此关联。高通量的微生物蛋白质组学研究从整体上揭示了与低温胁迫相关代谢和信号网络应答机制，显示腐败希瓦氏菌可以全面调节碳与能量代谢、信号传导与物质转运、基因表达与蛋白质合成，以及包括氨基酸、核酸、脂肪酸等多种物质的代谢过程，以维持细胞相对正常的代谢水平。研究结果为深入分析腐败希瓦氏菌应对低温胁迫的网络调控机制提供了重要信息，也为探析腐败希瓦氏菌野生菌株适冷机制提供了理论参考依据。