鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺优化

何云，汪有先，赵淑静，包建强

（上海海洋大学食品学院，上海201306）

鮟鱇鱼（Lophius litulon），俗称结巴鱼、哈蟆鱼、海 哈蟆、琵琶鱼等，属冷温性底层鱼类，常栖伏海底，于世界各大海洋均有分布，如大西洋、太平洋和印度洋。头大、身小，体柔软，无鳞，内脏比重大，出肉率低，在加工过程中会产生60%以上[1]的下脚料，鱼骨占了脚料的15%[2]。开展对鮟鱇鱼骨的精深加工研究可以使鮟鱇鱼骨资源得以合理开发利用，从而利于提高其加工的综合效益及经济附加值。市面上的补钙剂主要有三类，分别是有无机钙、有机钙和氨基酸钙。但是无机钙生物效价低、有机钙溶解度大易溶失且价格高、氨基酸螯合钙会产生颜色反应并引发脂肪氧化[3]，且总体利用率不高，逐渐被第四代补钙产品——胶原多肽螯合钙[4]代替。胶原多肽螯合钙作为新型的补钙剂，可使钙以离子形式与小肽结合，并借助小肽的转运、吸收机制，以配合物的形式被小肠吸收，故而显著促进钙的利用率，且肽-Ca螯合物吸收速度快且可以减少很多生化过程，节约机体能量消耗[5]。多肽螯合钙具有生物效价高、吸收快、营养高等优点，具有抗氧化、抗菌、免疫调节、降血脂和降血糖等活性，有很高的开发价值和应用前景，日益成为国内外研宄的热点[6-7]。

本研究以鮟鱇鱼骨为原料，经盐酸法提取鱼骨中钙源后，胃蛋白酶酶解获得鱼骨多肽，向其加入提取出的钙源，制备胶原多肽螯合钙。通过单因素试验和正交试验，确定最佳的螯合条件，并对其进行氨基酸分析，旨在为钙补充剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鮟鱇鱼：舟山兴业有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg～3 500 U/mg）：北京盈信阳光生物科技有限公司；牛血清、HCl、NaOH、无水乙醇、NaCl等：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

原子吸收分光光度计（TAS-990）、T6新世纪型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；L-8800型氨基酸分析仪：天美（中国）科学仪器有限公司；FOSS8400型全自动凯氏定氮仪：上海瑞玢国际贸易有限公司；Seven2Go型pH计、ME204型分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DK-S28型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；H1850R型高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9070A型鼓风干燥箱：上海鳌珍仪器制造有限公司；LFP-800T型多功能粉碎机：浙江省永康市红太阳机电有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮟鱇鱼骨胶原多肽酶解液的制备

新鲜冷冻的鮟鱇鱼→预处理→提取钙液→离心→酶解→离心→鱼骨胶原多肽酶解液

鱼骨胶原多肽酶解液的制备：取清洗干净、脱脂、脱杂蛋白、经80℃鼓风干燥箱烘干9 h的鱼骨，粉碎后过60目筛，用6.0%盐酸浸泡、搅拌、脱钙（60 min，40℃，料液比 1∶6（mg/m L），脱钙率达到 31.21%，得钙液）；胃蛋白酶（3 000 U/mg～3 500 U/mg）酶解[料液比1 ∶15（mg/mL），温度 40 ℃，时间 4 h，p H 1.0，加酶量6%（质量分数）]，100℃灭酶 5 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，70℃条件下活性炭吸附（添加量1%（质量分数）），采用0.22 μm滤膜过滤（0.1 MPa，常温），浓缩（45℃，0.1 MPa），制得鮟鱇鱼骨胶原多肽酶解液。

1.3.2 鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺流程

鱼骨胶原多肽酶解液→调节螯合条件（温度、pH、质量比、时间）→螯合→3倍无水乙醇沉淀螯合物→离心（8 000 r/min；10 min），收集沉淀→真空冷冻干燥（-108 ℃[16]，4.0 Pa，36 h～48 h）。

1.3.3 检测方法

钙含量的测定：火焰原子吸收光谱法（GB5009.92-2016《食品安全国家标准食品中钙的测定》）。

计算公式如下：

1.3.4 螯合反应单因素试验

根据单一因素对胶原螯合钙工艺参数的相关研究，在水系中合成胶原多肽螯合物时，影响合成反应的主要因素有：质量比、pH、螯合时间、螯合温度等。因此，试验以质量比、pH、螯合时间、螯合温度为考察因素。

1.3.4.1 最佳质量比的确定

胶原多肽与钙离子的结合有一定的配位比，设定pH 6.0、时间50 min、温度50℃条件下，选择酶解液中胶原多肽与钙液的质量比为 0.5 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4∶1，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标确定最佳的质量比。

1.3.4.2 最佳pH值的确定

设定质量比为1∶1、时间50 min、温度50℃，选择pH 为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标确定最佳的pH值。

1.3.4.3 最佳螯合时间的确定

设定质量比为1∶1、pH 6.0、温度50℃，选择时间为 30、40、50、60、70 min，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标确定最佳的螯合时间。

1.3.4.4 最佳螯合温度的确定

设定质量比为 1 ∶1、pH 6.0、时间 50 min，选择温度为 30、40、50、60、70 ℃，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标确定最佳的螯合温度。

1.3.5 正交试验

在单因素试验的基础上，以胶原多肽与钙液质量比、pH值、螯合时间、螯合温度为影响因素，各选取3个水平，采用L9（34）试验设计，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标，确定鮟鱇鱼骨螯合钙的最佳工艺条件。试验因素及水平见表1。

表1 正交试验设计表Table 1 Orthogonal experimental design

1.3.6 螯合物中氨基酸组成成分分析

用氨基酸分析仪测定样品氨基酸组成。取0.500 0 g的鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合钙冻干粉样品，加入10 mL，6 mol/L HCl，加入3～4滴苯酚，水解管放入冷冻剂中3 min～5 min，吹氮气后封口，在110℃的恒温鼓风干燥箱内水解22 h，过滤，再溶解并定容至50 mL容量瓶。吸取1.0 mL作为测定氨基酸组成用的分析样。

1.3.7 数据处理

所有指标均重复测定3次，采用Origin 8.0和Excel2003进行作图，用SPASS 19.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 胶原多肽与钙液质量比对螯合反应的影响

胶原多肽与钙液质量比对螯合反应的影响见图1。

图1 酶解液中胶原多肽与钙液的质量比对螯合率和螯合物中钙含量的影响Fig.1 Effect of protein to calcium solution mass ratio on chelating rate and chelated calcium content

由图1知，酶解液中胶原多肽与钙液的质量比对螯合率和螯合物中钙含量影响显著。配位体质量过高，肽的利用率下降，配位体过低，螯合物不稳定[8]。在质量比为0.5∶1时，螯合物中钙含量比较高，螯合率比较低，原因是很多钙离子未参与螯合反应。随着质量比的不断增加，胶原蛋白结合位点的增多，螯合率不断升高。当质量比达到2∶1后，螯合率最高，说明配体质量比的增大有利于螯合反应的充分进行。当配体的质量比大于2∶1后，鳌合率降低，说明有多余的胶原多肽未被螯合，造成胶原多肽浪费。刘永等[9]优化罗非鱼鳞胶原蛋白肽钙螯合物的制备工艺时发现，螯合率随肽与氯化钙质量比的增加而迅速增加，在3∶1时达到最高，继续升高二者比例，螯合率降低。

2.2 螯合pH值对螯合反应的影响

螯合pH值对螯合反应的影响见图2。

图2 pH值对螯合率和螯合物中钙含量的影响Fig.2 Effect of pH on chelating rate and chelated calcium content

由图2可知，pH对于螯合率和螯合物中钙含量影响显著，酸性条件和碱性条件下螯合率和螯合物中钙含量均相对较低。其原因是在低pH条件下，溶液中H＋大量存在时，H＋会与Ca2＋争夺供电子基团，呈竞争关系，羧基配位能力较弱，不利于螯合物的形成[10]；而在高pH条件下，OH－与供电子基团争夺钙离子而形成氢氧化钙沉淀[11]，经无水乙醇洗后被除去。在弱酸、弱碱及中性条件下，配体受H＋和OH－影响较小，提供了充分的供电子基团，从而有利于钙通过配位键形成螯合物[12]，与丁利君等[13]研究结果相似，在pH值影响下螯合率均呈现先增加后减小趋势。

2.3 螯合温度对螯合反应的影响

螯合温度对螯合反应的影响见图3。

由图3可知，随着温度的升高，胶原多肽螯合率呈增大趋势，40℃之后呈降低趋势，螯合物中钙含量先缓慢减少，40℃之后缓慢增加。夏光华等[14]研究发现螯合反应属于放热反应，温度过高不利于螯合反应的进行，故而在温度过高的情况下，螯合率呈下降趋势。螯合物中钙含量下降可能是因为温度超过一定值，使胶原多肽螯合钙发生部分分解，多肽螯合钙是通过多肽的N-端氨基、C-端羧基、氨基酸侧链以及肽链中的残基和亚氨基与Ca2＋配位形成，此外，多肽对钙还有吸附作用[15]，故而螯合物中钙含量增加。

图3 温度对螯合率和螯合物中钙含量的影响Fig.3 Effect of chelating temperature on chelating rate and chelated calcium content

2.4 螯合时间对螯合反应的影响

螯合时间对螯合反应的影响见图4。

由图4可知，螯合时间在30 min～50 min时，随着时间的延长，螯合率和螯合物中钙含量不断升高，随后螯合率和螯合物中钙含量不断下降，可能在开始阶段，螯合时间短，反应不彻底，游离钙和配体充足；随着螯合时间延长，已经螯合的胶原多肽螯合钙发生了解离，螯合率和螯合物中钙含量不断下降，可能由于羰基与氨基发生了羰氨反应，减少了可以与钙发生螯合的羰基和氨基的数量[16]，此结果与赵妍嫣等研究结果相符[17]。

图4 螯合时间对螯合率速率的影响Fig.4 Effect of time on chelating rate and chelated calcium content

2.5 正交试验设计与结果分析

单因素试验最佳工艺参数：胶原多肽与钙液质量比 1 ∶1，2 ∶1，3 ∶1，pH 4～6，螯合时间 30 min～50 min，温度30℃～50℃。根据单因素试验结果，选定各因素较佳条件进行正交试验，试验结果见表2，方差分析见表3。

表2L9（34）正交试验Table 2L9（34）orthogonal experiment analysis

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

以鳌合率为指标影响鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合反应的主次顺序为：pH（D）＞螯合温度（C）＞螯合时间（B）＞质量比（A），优化工艺后最佳工艺组合为A2B3C1D3，即质量比2∶1，螯合时间50 min，螯合温度30℃，pH 6，其主体间效应的检验显示A、B、C、D间差异性显著。以螯合物中钙含量为指标影响鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合反应的主次顺序为：pH（D）＞质量比（A）＞螯合时间（B）＞螯合温度（C），优化工艺后最佳工艺组合为A1B3C2D3，即提质量比 1∶1，螯合时间 50 min，螯合温度40℃，pH 6，其主体间效应的检验显示 A、B、C、D 间差异性显著。

表4 验证试验结果Table 4 Experiment results of verification

通过调整试验方案，在A2B3C1D3条件下，鳌合率为98%，螯合物中钙含量为21.29%，在A1B3C2D3条件下进行试验，鳌合率为97.17%，螯合物中钙含量为20.98%。由试验结果知，A2B3C1D3条件下鳌合率最大为98%，且螯合物中钙含量最高为21.29%，故其最优工艺组合为：A2B3C1D3即胶原多肽与钙液质量比2∶1，螯合时间50 min，螯合温度30℃，pH 6。此结果略高于杨燊[18]、陆剑锋[19]、黄薇等[20]分别对南海低值鱼蛋白、斑点叉尾鮰鱼骨胶原多肽、鳕鱼皮复合肽与钙的螯合率，且螯合物中的钙含量高于彭巧云等[21]的研究结果。产生这种差异的原因，可能是由于原料种类、胶原多肽的氨基酸组分、胶原多肽分子质量等不同，导致最佳螯合条件不同，使其螯合率及螯合物中钙含量高低不同。

2.6 胶原多肽螯合钙的氨基酸组成分析

在优化条件下制备的胶原多肽螯合钙经酸解后，进行氨基酸组成成分分析，测定结果如表5所示。

表5 螯合钙中氨基酸组分Table 5 Amino acid composition of calcium-chelating collagen polypeptide

螯合钙中的未检测到色氨酸，酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸含量较少，谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸含量较多其中脯氨酸与羟脯氨酸含量约占总氨基酸含量的17.37%，符合胶原多肽的氨基酸组成[22]。

3 结论与讨论

本试验首次选用鮟鱇鱼骨制备胶原多肽，并与钙进行螯合，得到既能够补充人体胶原多肽，又能补充人体钙的胶原多肽螯合钙。通过单因素和四因素三水平正交优化试验，得到胶原多肽液和钙离子的最佳螯合条件为：温度30℃、pH6、时间50 min，胶原多肽与钙的配比为2∶1，此条件下的钙螯合率为98%，螯合物中钙含量为21.29%。

对螯合物进行氨基酸分析，具有典型的胶原多肽氨基酸组成特征。红外光谱分析表明胶原多肽的氨基和羧基都与钙发生了配位、离子结合，胶原多肽与钙进行了成功的螯合。电镜扫描分析表明部分钙离子吸附在胶原多肽上，说明胶原多肽与钙离子也有一定的吸附作用。

胶原多肽螯合钙是由鱼骨胶原多肽与钙离子螯合而成，在螯合过程中胶原多肽除了与钙离子发生螯合作用外，同时还存在其他一些羰氨反应等，若发生羰氨会减少与钙离子螯合的胶原多肽基团。胶原多肽螯合钙的功能性、毒性、溶解性、稳定性和不同分子质量的吸收性，可能因不同胶原多肽分子量不同而不同，以及胶原多肽螯合该的氨基酸组成序列，均可作为下一步研究的重点。