超声辅助法提取柿子叶中总黄酮工艺的研究

张立攀，周莉，关炳峰，王法云，刘红伟，高火亮，贾艳，罗蓓蓓，李鹏冲

（河南省商业科学研究所有限责任公司，河南郑州450000）

我国柿和柿子叶资源非常丰富，柿的种类超过40种，种植地域广泛，在东部、南部山区，华北、东北平原和西北高原地区均有分布[1-3]。现代社会对柿子的产品开发水平较高，包括各种即食、保健、发酵食品和美容及清洁产品，但是对柿子叶的产品开发较少。近来研究发现，柿子叶中复杂的化学成分中，某些成分对人体健康有很大益处，可用于咳喘、肺气胀的治疗以及其他临床疾病[4-10]的治疗。这些有益成分包括黄酮、酚类有机酸[11-14]、维生素类与微量元素等营养成分[15-17]。其中，黄酮是最重要的组分且含量较高。柿子叶资源丰富、来源广泛，而作为柿子叶中有益成分重要的组成，黄酮类化合物具有很多对健康有益的生理作用[18-19]，因此柿子叶总黄酮的研究及其相关的深加工产品开发，是对现有资源的深入开发和利用，具有良好的前景。

从各种植物中提取总黄酮的方法，经过几十年的发展，总的来说包括这几种：常温、低温、高温和高压提取法[20-23]。这些方法普遍存在一些弊端，如能耗高，工艺操作复杂，得率较低，设备要求高等。近年来，随着超声波技术的发展，开始有学者将超声波技术应用到提取植物中总黄酮类化合物中[24-32]。在提取植物有效成分时使用超声波技术有几大优势：一是提取得率明显升高；二是提取速度快；三是可以做到对有效成分的无损提取[33]。应用超声波技术研究提取柿子叶中总黄酮，确定总黄酮的得率为考量的指标，分别进行单因素和正交试验，得到高效的柿子叶黄酮类物质的提取工艺，为柿子叶的深度开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柿子叶：河南省商业科学研究所有限责任公司林地；芦丁（液相浓度≥98%）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇（C2H5OH）、亚硝酸钠（NaNO2）、九水合硝酸铝（Al（NO3）3·9H2O）、苛性钠（NaOH）均为分析纯。

UV-8000ST双光束紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；RE-2000A快速旋转蒸发仪：上海科升仪器有限公司；KQ-700DE型超声波发生器：上海昆山仪器有限公司；QJ-08B粉碎机：上海兆申科技有限公司；DHG-9052A型台式电热干燥箱：上海捷呈实验仪器有限公司；FA2004电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；AL204-ICF分析天平：梅特勒-托利多国际贸易有限公司；分样筛：上虞市五四仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 柿子叶预处理

柿子叶经自然风干后，在电热干燥烘箱烘焙至干，其烘制程序设定温度为50℃，时间为6 h；用粉碎机将烘干的样品磨碎，然后过60目分样筛并收集。

1.2.2 柿子叶总黄酮超声波辅助提取工艺

试验对象为预处理后的柿子叶粉。称取设定质量的柿子叶粉，加入到设定浓度和体积的溶剂中；然后，按照设定的超声浸提时间、超声浸提温度和超声浸提次数进行提取。提取物经过滤，少量溶剂润洗滤渣；所有滤液旋干，残留物用60%乙醇（体积比）溶解，并定容至100 mL容量瓶中，为样品待测储备液。

1.2.3 柿子叶总黄酮含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制

根据方法[24]测定芦丁的标准曲线为：y=9.173 2x-0.006 1，R2=0.999 7。标准曲线见图1。

1.2.3.2 总黄酮含量的测定

为提高试验的精密性，统一设定预处理柿子叶粉的称取重量为2.00 g，样品待测储备液的移取量为4.00 mL，定容至50 mL，按照方法[24]中的操作步骤进行测定。公式如下：

得率/%=（测定液中总黄酮的质量/柿子叶粉样品的质量）×25×100

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

计算不同试验组提取液的柿子叶提取物总黄酮含量。

1.3 柿子叶总黄酮超声波辅助提取单因素试验

1.3.1 溶剂中乙醇浓度的影响

取超声浸提温度50℃，并保持恒温状态，料液比取1∶20（g/mL），超声浸提时间取15 min，溶剂中乙醇浓度分别取 0、30%、50%、60%、70%、80%、95%，进行提取试验。研究不同溶剂中乙醇浓度与提取物得率的相互变化关系与趋势。

1.3.2 超声浸提温度的影响

溶剂中乙醇浓度恒定取60%，超声浸提时间取15 min，料液比取 1 ∶20（g/mL），超声浸提温度分别取30、40、50、60、70 ℃，进行提取试验。研究不同超声浸提温度与提取物得率的相互变化关系与趋势。

1.3.3 超声浸提时间的影响

溶剂中乙醇浓度恒定取60%，料液比取1∶20（g/mL），超声浸提温度取60℃，超声浸提时间分别取10、25、40、55、70、85 min，进行提取试验。研究不同超声浸提时间与对提取物得率的相互变化关系与趋势。

1.3.4 料液比

溶剂中乙醇浓度恒定取60%，超声浸提时间取40 min，超声浸提温度取60℃，料液比分别取1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），进行提取试验。研究不同料液比与提取物得率的相互变化关系与趋势。

1.3.5 超声浸提次数的影响

溶剂中乙醇浓度恒定取60%，料液比取1∶25（g/mL），超声浸提温度取60℃，超声浸提时间取40 min，超声浸提次数分别取1、2、3、4分别进行试验。研究不同超声浸提次数与提取物得率的相互变化关系与趋势。

1.4 柿子叶总黄酮超声波辅助提取的正交试验

通过对单因素试验结果的分析，得知超声浸提次数对提取物得率的影响较小。故选择影响因素较大的溶剂中乙醇浓度、超声浸提温度、超声浸提时间和料液比进行正交试验。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 溶剂中乙醇浓度的影响

溶剂中乙醇浓度与柿子叶总黄酮提取得率的变化关系见图2。

图2 溶剂中乙醇浓度与柿子叶总黄酮提取得率的变化关系Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from persimmon leaves

由图2可知：在设定的溶剂中乙醇浓度范围内，当溶剂中乙醇浓度低于60%时，随着溶剂中乙醇浓度的增加，得率先升高，在达到60%时开始下降。这可能因为大于此浓度时，柿子叶中某些脂溶性物质溶出增加，对得率造成影响[34]。故选取溶剂中乙醇浓度为55%～65%。

2.1.2 超声浸提温度的影响

超声浸提温度与柿子叶总黄酮提取得率的变化关系见图3。

图3 超声浸提温度与柿子叶总黄酮提取得率的变化关系Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids from persimmon leaves

由图3可知，在设定的超声浸提温度范围内，得率以60℃为分界点表现出先升高后降低的趋势。这是由于温度继续升高时，可溶性蛋白质溶出变性，溶液黏度增大，影响细胞的破裂，抑制了黄酮类物质的溶出，降低了得率[34]。故选择超声浸提温度58℃～62℃。

2.1.3 超声浸提时间的影响

超声浸提时间与柿子叶总黄酮提取得率的变化关系见图4。

图4 超声浸提时间与柿子叶总黄酮提取得率的变化关系Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids frompersimmon leaves

由图4可知，按照设定的超声浸提时间范围，提取物得率迅速升高，在达到40 min以后出现轻微下降。这可能是在超声波作用下，目的物的溶出在较短的时间内就达到平衡了，而后随着时间的增加，溶剂有逸失造成的[35]。故选择超声浸提时间40 min～55 min。

2.1.4 料液比的影响

料液比与柿子叶总黄酮提取得率的变化关系见图5。

图5 料液比与柿子叶总黄酮提取得率的变化关系Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the yield of total flavones from persimmon leaves

由图5可知，在设定的料液比范围内，得率随着溶剂量的增加而逐渐增大，在料液比1∶25（g/mL）时，再增加溶剂，得率反而趋于稳定。增加溶剂，使得黄酮类化合物分子传质到溶液中的总量在增多，在料液比达到1∶25（g/mL）以后黄酮类的浸出趋于稳定，继续增加溶剂量只会增加杂质的浸出。故选择料液比为1 ∶22（g/mL）～1 ∶27（g/mL）。

2.1.5 超声浸提次数的影响

超声浸提次数与柿子叶总黄酮得率的变化关系见图6。

图6 超声浸提次数与柿子叶总黄酮得率的变化关系Fig.6 Effect of extraction times on the yield of total flavonoids from persimmon leaves

根据图6可得到结论：在超声浸提次数2次时，得率迅速达到最大值并保持基本恒定，且提取次数取1和2时，得率相差较小。这说明超声波辅助提取的效率的确是较高的，同时一定程度上也说明超声提取次数对得率的影响因素相对较小。故选择提取次数为2次。

2.2 柿子叶总黄酮提取的正交试验

据因素水平表，并按照试验中提取物的操作步骤进行正交试验分析结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交结果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test method

续表3 方差分析Continue table 3 Variance analysis of orthogonal test method

根据表2、表3的结果，可以判断出：对柿子叶中提取物总黄酮得率影响，在各个因素条件中，溶剂中乙醇浓度具有较大显著性；各因素条件的影响大小依次为：溶剂中乙醇浓度＞料液比＞超声浸提温度＞超声浸提时间。说明溶剂中乙醇浓度在超声辅助提取柿子叶总黄酮的过程中起着首要作用。正交优化后的最优提取条件组合为A2B2C2D3，即溶剂中乙醇浓度取60%，超声浸提温度取60℃，超声浸提时间取50 min，料液比取1∶27（g/mL）；为验证正交设计试验的结果，在此最优条件下，5次平行验证试验提取物总黄酮的得率平均值达到4.82%。

3 结论

首先设计单因素试验，研究了各个因素条件与提取物总黄酮得率的相互变化关系或趋势；并在此基础上，通过正交设计优化试验得到最优工艺。结果表明提取物总黄酮得率的影响因素的主次顺序为：溶剂中乙醇浓度＞料液比＞超声浸提温度＞超声浸提时间；最优工艺条件为：超声浸提次数2次、超声浸提时间50 min、超声浸提温度60℃、溶剂中的乙醇浓度60%、料液比1∶27（g/mL）；在此最优组合条件下，测定提取物的得率为4.82%。