云南少数民族地区新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血基因型研究

欧阳红梅，高玉红，杨必清，陆兴热，蒋雅先，杨同华

(1.云南省第一人民医院/昆明理工大学院附属医院检验科，昆明 650032；2.云南省德宏傣族景颇族自治州人民医院检验科，云南芒市 678400；3.云南省文山壮族苗族自治州人民医院检验科，云南文山 663000；4.云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院血液科，昆明 650032)

珠蛋白生成障碍性贫血是人类最常见且危害最大的单基因遗传病之一。2006年资料显示，云南省珠蛋白生成障碍性贫血发病率居全球之首[1]，以边境少数民族为高发人群。2011-2013年调查显示云南边境地区珠蛋白生成障碍性贫血检出率相对更高占20.9%，尤以德宏州居首(人群检出率43.1%)[2-3]，所以目前珠蛋白生成障碍性贫血仍是云南省特别是边境少数民族地区危害较重的地方病。α-珠蛋白生成障碍性贫血是由于α-珠蛋白基因缺失或非缺失突变使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血。由于珠蛋白生成障碍性贫血基因携带率存在明显的地域差异，本研究旨在初步了解云南少数民族地区新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带特征，为云南α-珠蛋白生成障碍性贫血三级预防提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机收集文山壮族苗族自治州(简称文山州)、德宏傣族景颇族自治州(简称德宏州)2016年11月至2017年3月出生的新生儿(年龄1～28 d)足跟血的干血斑210例(其中非汉族131 例、汉族79例；乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝血198例，其中非汉族121例，汉族77例。孕周为35～40周，2～8 ℃冷藏保存，7～15 d内冷藏运输至云南省第一人民医院完成检测。家属签署知情同意书，登记受检者姓名、编号、年龄、性别，民族、孕周及其父母的相关信息。民族分布情况见表1。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 全自动毛细管电泳仪(法国Sebia Capillarys Neonat Fast及Capillarys Flex Piercing)， PCR仪T100 Thermal Cycler、水平电泳仪Mini-Sub Cell GT、凝胶成像仪GelDoc EZ、荧光定量PCR仪CFX96 Touch、熔解曲线突变分析软件CFX Manager3.1(美国Bio-rad),X1R台式冷冻离心机(美国Thermo Fisher)，ND-1000 型紫外分光光度计(NanoDrop 公司)。

1.2.2试剂 毛细管电泳仪质控品及所用检测试剂均为Sebia公司配套的珠蛋白生成障碍性贫血检测试剂盒。磁珠法DNA提取试剂盒(UPure Blood DNA Extraction试剂盒2.0、UPure Swab DNA试剂盒，成都新百基)，常见缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测试剂盒(广州达安基因有限公司)，常见非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测试剂盒(厦门致善生物科技有限公司产品)。

1.3方法

1.3.1毛细管血红蛋白(Hb)电泳 按照仪器操作规程完成质控标本、新生儿干血斑及抗凝血标本毛细管Hb电泳检测，记录HbBart′s水平。

1.3.2分子生物学

1.3.2.1DNA提取及测定 使用成都新百基UPure Blood DNA Extraction试剂盒2.0及UPure Swab DNA试剂盒磁珠法提取新生儿抗凝全血、干血斑中DNA。紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度，DNA样本的A260 nm/A280 nm应在1.6～2.0范围之间，且A260 nm/A230 nm≥2.0 (若A260 nm/A230 nm<2.0，需要使用试剂盒中提供的DNA溶解液将DNA标本进行适度稀释，但需保证样本浓度大于1 ng/μL)。DNA记录浓度后放置在-20 ℃冰箱备用。

1.3.2.2跨越裂隙PCR(gap-PCR) 检测3种常见缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因(--SEA-αα、-α3.7-αα、-α4.2-αα)，严格按照试剂盒说明书进行检测和结果判读。PCR反应条件：94℃ 3 min；随后94 ℃ 45 s，62 ℃ 90 s，72 ℃ 2 min，共5个循环；然后94 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30个循环；最后72 ℃ 7 min。阴性质控应无任何扩增产物，正常个体及正常质控仅在1.8 kb处有1个扩增产物、阳性质控在1.8、1.3 kb处有扩增产物。

1.3.2.3荧光定量PCR熔解曲线法 检测3种常见非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因(αCSα/、αQSα/ 和αWSα/)。PCR反应条件：50 ℃ UNG酶处理2 min，95 ℃ 10 min；随后95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s(每个循环下降1 ℃)，76 ℃ 20 s，共10个循环；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，76 ℃ 20 s，共50个循环；最后，95 ℃ 1 min，35 ℃ 3 min。设置溶解曲线分析程序：40～80 ℃，此阶段每0.4 ℃采集1次FAM、HEX和ROX通道荧光信号。

1.3.2.4罕见突变检测 对Hb电泳HbBart′s≥0.1%且未检出常见α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失及非缺失标本，再行4种罕见缺失型 --THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα，-α20.5/αα多重PCR检测。参照文献[4]设计引物，引物序列见表2。PCR 反应体系包括：5 μL 2×GC buffer Ⅰ、250 μmol/L dNTP、正反向引物各0.16 μmol/L、Taq DNA 聚合酶0.5 U、15～25 ng

表1 文山及德宏两地区民族构成分布情况[n(%)]

-:此项无数据

基因组DNA模板。PCR反应条件：96 ℃ 15 min；随后98 ℃ 45 s，60 ℃ 90 s，保存或立即用2%琼脂糖凝胶电泳。对以上罕见缺失检测阴性的样本进行α1-珠蛋白基因和α2-珠蛋白基因的PCR扩增产物测序。从UCSC 数据库(http://genome.ucsc.edu)中获取α-珠蛋白基因(α1-和α2-基因)的DNA序列。引物参照文献[5]，分别扩增α1-和α2-珠蛋白基因(包含3个外显子及部分上游和下游序列)，引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列见表3。PCR 扩增：α1-和α2-珠蛋白基因的PCR反应体系相同，总体积为50 μL(包括：25 μL 2×GC buffer Ⅰ、750 μmol/L dNTP、正反向引物各6.4 pmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U、100 ng基因组DNA模板)。扩增α1-珠蛋白基因的PCR反应条件：95 ℃ 5 min;随后95 ℃ 40 s，62.5 ℃ 40s，72 ℃ 100 s，共35个循环；然后72 ℃ 3 min；4 ℃保存。扩增α2-珠蛋白基因的PCR反应条件：95 ℃ 5 min；随后95 ℃ 40 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 100 s，共35个循环；然后72 ℃ 3 min；4 ℃保存。PCR扩增完成后，先取2～3 μL产物用2%琼脂糖凝胶电泳，确定成功扩增并获得特异性片段，将剩余PCR产物用于DNA测序。测序过程委托生工生物工程(上海)有限公司完成。用chromas 及clustalx 软件分析DNA测序结果。

表2 罕见缺失型 --THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα， -α20.5/αα引物序列

表3 α1-和α2-珠蛋白基因引物序列

2 结 果

2.1常见α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测 对文山州210例、德宏州198例新生儿标本行gap-PCR、荧光定量PCR熔解曲线法检测3种常见缺失型和非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因(--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、αCSα/αα、αQSα/αα和αWSα/αα)，文山州检出8例，其中--SEA/αα缺失4例(图1)，-α3.7/αα缺失4例；德宏州检出7例，其中-α3.7/αα缺失5例(图2)，αCSα/突变2例(图3)。

M：DNA分子标记物；-：阴性对照；+:阳性质控品；11：--SEA/αα缺失

图1 gap- PCR基因扩增产物电泳图

M：DNA分子标记物；D53：-α3.7/αα缺失

图2 gap- PCR基因扩增产物电泳图

图3 荧光定量PCR熔解曲线法检测αCSα/突变(阳性)

2.2罕见α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测 文山州新生儿标本中检出Hb Bart′s带17例，德宏州检出HbBart′s带14例，其中11例检出常见缺失型和非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因，对其余20例标本行罕见缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因(--THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα，-α20.5/αα)检测。文山州检出--FIL/αα缺失5例，德宏州--FIL/αα缺失7例，见图4。对罕见缺失检测阴性的8例标本行PCR 产物直接测序分析α1-和α2-珠蛋白基因的全长，其α1-珠蛋白基因测序均为正常基因，而α2-珠蛋白基因基因均发现在5′UTR区位于基因第8个氨基酸，第24个碱基存在由G>C的同译突变。文山州罕见非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变αα/αTα 6例，德宏州αα/αTα罕见突变2例。

红色箭头所指为--FIL/αα罕见缺失

图4多重PCR扩增产物电泳结果

2.3两少数民族地区新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血的携带率及基因型

2.3.1文山州 文山州210例新生儿标本中，检出α-珠蛋白生成障碍性贫血基因19例，α-珠蛋白生成障碍性贫血携带率占9.0%(19/210)，基因型4种，其中罕见非缺失突变αα/αTα 6例,构成比31.6%(6/19)，携带率2.85%(6/210)，罕见缺失--FIL/αα 5例,构成比26.3%(5/19)，携带率2.38%(5/210)，两种常见缺失-α3.7/αα及--SEA/αα均为4例，构成比21.05%(4/19)，携带率1.90(4/210)，未检出常见-α4.2/αα缺失及3种常见突变。见表4、5。

表4 云南少数民族地区α-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带率[n(%)]

2.3.2德宏州 德宏州198例新生儿标本中，检出α-珠蛋白生成障碍性贫血基因16例，α-珠蛋白生成障碍性贫血的携带率8.1%(16/198)，基因型4种，其中罕见缺失--FIL/αα缺失7例，构成比43.7%(7/16)，携带率3.54%(7/198)，常见-α3.7/αα缺失5例，构成比31.3%(5/16)，携带率2.53%(5/198)，常见αCSα/αα突变及罕见非缺失突变αα/αTα均2例，构成比12.5%(2/16)，携带率1.01%(2/198)，未检出常见-α4.2/αα及αα/--SEA缺失。见表4、5。

表5 云南少数民族地区α-珠蛋白生成障碍性贫血基因型构成比[n(%)]

-：此项无数据

3 讨 论

α-珠蛋白生成障碍性贫血基因位于染色体16p13，每条染色体上有两个连锁的α-珠蛋白基因α1-和α2-，分别长约1 kb，共4个，正常人以αα/αα表示。α-珠蛋白生成障碍性贫血可分为缺失型和非缺失型。缺失型是由于缺失染色体上1个(-α)或2个(--)α-珠蛋白基因；非缺失型是由于染色体上α1珠蛋白基因(ααT)或α2珠蛋白基因(αTα)发生突变。

全球已报道的缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血超过20种，世界上不同种族其α-珠蛋白基因缺失谱不同。报道的中国人缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血有14种，其中常见的缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血是东南亚缺失型(--SEA/αα)、右侧缺失型(-α3.7/αα)、左侧缺失型(-α4.2/αα)[6-7]。罕见缺失型分别是泰国缺失型(--THAI/αα)、菲律宾缺失型(--FIL/αα、--HW/αα、--FZ/αα、--11.1/αα、-α2.7、-α2.4、-α2.8、-α21.9、-α27.6、-α28.5)[8-12]。目前中国报道的非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血有13种，较常见的有HbConstant Spring(Hb CS，CD142 TAA→CAA)、Hb Quong Sze(HbQS， CD125 CTG→CGG)、Hb Westmead (Hb WS，CD122CAC→CAG)。临床工作中，检测3种常见缺失型基因(--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα)及3种常见非缺失型基因(αCSα、αQSα及αWSα)，就能检出约98% α -珠蛋白生成障碍性贫血基因。

本研究采用gap-PCR、荧光定量PCR熔解曲线法对文山州210例、德宏州198例新生儿标本检测3种常见缺失型和非缺失型αα-珠蛋白生成障碍性贫血基因 (--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、αCSα/αα、αQSα/αα 和αWSα/αα)，检出α-珠蛋白生成障碍性贫血基因15例，其中文山州8例、德宏州7例；有4例(3例-α3.7/αα，1例ααCSα)α-珠蛋白生成障碍性贫血阳性标本在毛细管电泳仪上无HbBart′s带检出，提示采用毛细管电泳法检测HbBart′s带用于筛查新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血存在漏检静止型α-珠蛋白生成障碍性贫血。

两地区共检测出HbBart′s带阳性(HbBart′s带大于或等于0.1%)标本31例，其中检出常见缺失及突变基因型为11例，其余20例标本再行罕见缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因(--THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα，-α20.5/αα)检测及珠蛋白基因测序分析。结果显示检出罕见--FIL/αα缺失12例，罕见缺失均阴性的8例，并对8例PCR产物检测α1-和α2-珠蛋白基因的全长，α2-珠蛋白基因均为正常基因，α2-珠蛋白基因均发现在基因的5′UTR区位于基因第8个氨基酸，第24个碱基存在由G>C的同译突变。该突变属于已知突变，在NCBI数据库中编号为rs71382271，该突变不位于蛋白编码区，但可能影响该基因的表达。即检出罕见α2-珠蛋白基因突变αα/αTα 8例。

本研究显示文山州210例新生儿标本中，壮族59例，占28.1%，彝族41例，占19.5%，为该研究群体中比例较高前两位，其α-珠蛋白生成障碍性贫血的携带率为9.0%。德宏州198例新生儿标本中，傣族66例，占33.3%，景颇族27例，占13.6%，为该研究群体中比例较高前两位，其α-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带率8.1%，表明云南两少数民族新生儿群α-地贫基因携带率与2015年HUANG等[13]报道的云南α-珠蛋白生成障碍性贫血的携带率9.7%相近。目前研究显示国内α-珠蛋白生成障碍性贫血基因型是以-α3.7/αα及--SEA/αα为前两位，并以地域差异两者位次有所不同[14]。本研究显示两少数民族新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血基因型构成比文山以罕见突变αα/αTα、--FIL/αα缺失(构成比分别为31.6%、26.3%)、德宏州以--FIL/αα和-α3.7/αα缺失(构成比分别为43.7%、31.3%)为前两位。提示云南两少数民族地区α-珠蛋白生成障碍性贫血基因型有其独特构成比。

--FIL/αα缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血是1988年由FISCHEL等[15]发现，迄今为止，仅在中国台湾、菲律宾人群中检出--FIL/αα[16-17]，中国大陆仅2017年黎永鉴等[18]报道在广西壮族自治区梧州市检出1例--FIL/αα缺失。本次研究发现多例罕见--FIL/αα缺失，且以较高比例存在于云南两少数民族新生儿群体中，与2017年杨阳等[19]报道云南省α-珠蛋白生成障碍性贫血等位基因构成比及其他文献[20]报道中国南方各个地区等位基因构成比均存在明显差别。

综上所述，本研究显示云南省文山州及德宏州两少数民族地区新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带率与文献报道相符，约10%；首次在中国大陆检出多例罕见α-珠蛋白生成障碍性贫血基因---FIL/αα缺失型，并以较高构成比存在于云南省文山州及德宏州两少数民族地区新生儿群体中，提示云南少数民族地区α-珠蛋白生成障碍性贫血基因型有其独特构成比，为下一步制订云南少数民族地区α-珠蛋白生成障碍性贫血基因筛查及三级预防措施提供了科学依据。