稀土铕双功能螯合剂的合成

赵啟含，常宇，马玉芹，潘利华

（1.长春理工大学 化学与环境工程学院，长春 130022；2.中国科学院长春应用化学研究所，长春 130022）

均相时间分辨荧光免疫分析（HTRF）是一种快速、简便且抗干扰性强的分析技术，是将荧光共振能量转移（FRET）技术和时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）相结合而形成的一种新的方法[1-3]。TRFIA是以稀土离子螯合剂为标记物进行检测分析，利用镧系元素的荧光特性可以有效地排除非特异荧光的干扰。而HTRF是在其基础上利用免疫反应生成免疫复合物的标记信号与未反应的标记物信号之间明显的差异进行分析检测的，所以在溶液中不需分离处理便可直接进行测定。HTRF具有操作简单、高特异性、高灵敏度、高稳定性、水溶性等优异特点[4-7]，在临床医学、化学分析等领域[8-11]受到大量关注。

HTRF中设计合成具有高稳定性、高灵敏度、高特异性、良好水溶性的穴状双功能稀土螯合剂是极具挑战性的工作。该类螯合剂的双功能性表现在可同时与蛋白质和稀土离子连接，连接后，不会影响蛋白质活性且具备稀土离子的优异性质。

本实验从HTRF的需求考虑，设计制备一种稀土铕双功能螯合剂。以2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯为原料，合成2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2’-联吡啶-6，6’-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu3+，通过IR、MS等表征方法确认各合成产物的结构。并对其光谱性质进行研究。螯合剂的结构及合成路线如图1所示。

图1 所合成的配体及螯合剂的结构及合成路线

1 实验

1.1 主要仪器和试剂

FTSB5傅立叶红外光谱仪（上海大中分析仪器厂）；DSC-7差热分析仪（美国Pericin Elmer公司）；7.0 T型超导磁体型傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（美国IonSpec公司）；Unity-400MHz核磁共振仪（美国Varian公司）；Hitachi F-7000型荧光光谱仪（日本HAMAMATSU公司）；C10027型光子多通道分析仪（日本HAMAMATSU公司）；FLSP-920型研究级光谱仪（英国爱丁堡仪器公司）；荧光寿命测量仪（课题组自主研制）。

2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯（济南某公司）；N-溴代丁二酰亚胺（肯特催化有限公司）；偶氮二异丁腈（江苏全威化工）；中性氧化铝（国药试剂）。C18反相硅胶（济南博纳生物技术）三氯甲烷、三氟乙酸、甲醇、叔丁醇等所用试剂规格均为AR级纯度。

1.2 中间体合成

1.2.1 2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（化合物P1）的合成

无水无氧条件下，将2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯（1g，5.54mmol），1.91g N-溴代丁二酰亚胺（NBS），四氯化碳（100ml）置于反应瓶中，搅拌10min，原料一部分溶解，加入0.04g偶氮二异丁腈（AIBN）。当温度为40℃时，50W卤素灯进行激发照射，将体系温度升高至77℃，在回流状态下反应2h，冷却至室温，用40ml饱和NaHCO3溶液洗，除去反应过程中产生的琥珀酰亚胺[12]，三氯甲烷萃取（20ml×4），有机相用无水Na2SO4干燥。隔天过滤，并在真空状态下除去溶剂，得到棕黄色油状液体。以柱层析方式纯化分离（淋洗剂：二氯甲烷），得到纯净的化合物P1。总收量215.4mg，总产率24.14%，封好放于干燥器内备用。

1.2.2 2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2'-联吡啶-6，6'-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸甲酯（化合物P2）的合成

无水无氧的条件下，将N，N'，N，N'-[二（2，2'-联吡啶-6，6'-二甲基）]二胺（133mg，0.338mmol）溶于乙腈（267ml）中，搅拌10min（固体一部分溶解），向溶液中加入251mg的Li2CO3，提升温度至反应液回流（80℃～83℃），60min后。向体系中滴加原料2化合物P1的乙腈溶液{P1（110mg，0.341mmol）+乙腈（67ml）}，控制滴加速率，2h内滴完。继续反应30h。冷却反应液至30℃，用250ml沙漏抽滤，真空状态下蒸干溶剂。用柱层析方式纯化分离（淋洗剂为V二氯甲烷：V甲醇=9：1），得到90.4mg的纯净的化合物P2，产率46.05%，封好放于干燥器内备用。

1.3 螯合剂合成

1.3.1 2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2'-联吡啶-6，6'-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸甲酯-Eu3+（化合物P3）的合成

氮气保护的状态下，将原料化合物P2（40mg，5.68×10-5mol）溶解于 10ml的无水甲醇中，固体全溶，搅拌状态下，将预先制备的EuCl3.6H2O（23.6mg）加入到反应瓶中，溶液呈无色透明状，升高温度至溶液沸腾回流（65℃～68℃），23h后反应结束，冷水浴冷却至室温，加入5ml乙醚，出现白色的絮状沉淀，抽滤、真空状态下将沉淀物烘干，得到乳白色固体粉末32 mg，即化合物P3，不进行纯化处理，封好放于干燥器内备用。

1.3.2 2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2'-联吡啶-6，6'-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu3+（化合物P4）的合成

将原料化合物P3在碱性条件下水解，除去甲酯基团，取化合物P3（20mg）溶于3mL无水CH3OH中，室温下搅拌，溶液呈无色透明状，将1mol/L的LiOH的水溶液0.1mL滴入反应体系，溶液变白色浑浊，再加入0.5mL的1mol/L的LiOH水溶液，浑浊度增大，室温下反应3.5h，蒸干反应溶剂，以C18反相硅胶为固定相进行柱层析纯化，对（乙腈：1%三氟乙酸水溶液=7：3，V：V），得到乳黄色粉末固体9mg，即Eu3+-螯合剂（化合物P4），产率为43.44%，粉末在紫外灯下照射可发出明亮的橘红色光，封好放于干燥器内备用。

1.3.3 化合物P4（螯合剂）溶液的配制

取0.81mg的化合物P4，用2ml的二次水溶解，固体全溶后，再用二次水定容到10ml的容量瓶中，配制成浓度为1×10-4mol/L的螯合剂水溶液。封好，用于检测螯合剂的激发光谱、荧光光谱以及荧光寿命。

2 结果与讨论

2.1 合成方法优化

2.1.1 化合物P1

利用NBS对原料溴化制备化合物P1，主要是NBS的溴自由基脱离并与原料进行连接的过程，此类反应过程中不仅需要光的照射激发还要用引发剂来促进反应的进行[8]，本文选用AIBN作为引发剂，并研究了不同光源照射以及NBS使用量等对化合物P1产率的影响。

（1）不同光源照射对化合物P1产率的影响

确定其他反应条件不变，研究不同光源照射对反应后化合物P1产率的影响。

用100W照明灯与50W卤素灯分别进行试验，两种灯光激发照射下，反应均可进行，但是照明灯在达到与卤素灯相同产率时，所用时间较长（4h，卤素灯为1h），两种灯光照射均用薄层色谱法（TLC）检测，可以发现卤素灯照射反应进程很快。虽产生副产物点稍多，但对化合物P1产率几乎无影响，这可能是因为卤素灯照射促进了溴自由基的生成，在较短的时间内即可产生大量的溴自由基，加快了反应进程。因此，综合考虑，本实验选用50W卤素灯进行照射。

（2）NBS使用量对化合物P1产率的影响

在其他反应条件为最佳的情况下，研究不同NBS使用量对反应后化合物P1产率的影响，研究结果如表1所示。

表1 NBS使用量对化合物1产率的影响

当NBS：2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯为1：1.9时化合物P1的产率最高。NBS含量过少的原因是，反应进行不完全，但是NBS过多时，反应液中溴自由基含量过多，生成过多的副产物（-CBr3/-CHBr2），使目标产物产率降低。

2.1.2 反应时间对化合物P2的影响

在其他反应条件为最佳的情况下，对化合物P2的反应时间进行优化，结果如表2所示。

表2 反应时间对化合物P2产率的影响

当反应时间为22h、26h时，反应不完全，目标产物产率较低，当反应时间为30h时，目标产物产率最高为46.05%。

2.2 合成产物的表征

2.2.1 2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（化合物P1）的表征

图2所示为2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（化合物 P1）的质谱，MS（70eV）m/z（%）：（M+H）+=324.0与化合物P1加氢的分子量理论值相符。

图3所示2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（P1）的核磁氢谱，δ：3.98有单峰，为酯中甲基的3个氢；δ：4.59有单峰为溴取代甲基中的4个氢，δ：7.92处的单峰为吡啶环中的2个氢，1H-NMR谱给出的各氢总数、出峰位置和化合物P1结构吻合。

图3 2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯的核磁（1H-NMR）谱图

图4所示为2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（P1）的红外光谱（a）与原料2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯的红外光谱（b）对比可知，在616～582cm-1出现C-Br键的特征吸收峰，说明原结构中的-CH3被溴化成功，其他特征峰位置基本不变。

图4 化合物P1（a）及其原料（b）的红外光谱（IR）

2.2.2 2，6-｛N，N ′，N，N ′-[二（2，2 ′-联吡啶-6，6′-二甲基）]二氨甲基｝-吡啶-4-羧酸甲酯（化合物P2）的表征

图5所示为化合物P2的核磁氢谱1H-NMR（以CDCl3作为测试溶剂，射频电磁波的频率为400MHz），δ：3.95～4.10分别为酯中甲基的3个氢以及6个亚甲基中的12个氢共15个氢；δ：7.41～7.90为吡啶环中的14个氢，1H-NMR谱给出的氢个数、特征峰位置和其分子结构相符。化合物P2的分子量理论值是555，图6所示为化合物P2的质谱图，MS（70eV）m/z（%）：（M+Na）+=578.2与化合物P2加钠的分子量理论值相符。

图5 化合物P2的1H NMR谱

2.2.3 2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2’-联吡啶-6，6’-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸甲酯-Eu3+（化合物P3）的表征

化合物P3的分子量理论值为708，图7所示为化合物P3的质谱，MS（70eV）m/z（%）：（L+Eu3++2Cl-）+=778.0与化合物P3加上稀土离子Eu3+以及中和其正电荷的两个氯离子Cl-的分子量理论值相符。

图7 化合物P3的质谱（MS）

2.2.4 螯合剂2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2'-联吡啶-6，6'-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu3+（化合物P4）的表征

螯合剂P4的分子量理论值是694.1，图8所示为Eu3+-螯合剂（化合物P4）的质谱，MS（70eV）m/z（%）：（L+Eu3+-H++CF3COO-）+=806.1与其加上CF3COO-的分子量理论值相符。

图8 Eu3+-螯合剂（化合物P4）的质谱（MS）

2.3 Eu3+-螯合剂（化合物P4）的荧光光谱分析

取1×10-4mol/L的Eu3+-螯合剂（化合物P4）溶液液，稀释其浓度至10-5mol/L，室温下测试其荧光性质，测试数据如表3所示。

表3 化合物P4的荧光性质

图9所示为Eu3+-螯合剂（化合物P4）在600V电压下的激发光谱和荧光光谱，该螯合剂的激发范围是230～330nm，最大激发波长为320nm，发射波长为 584nm（5D0-7F1）、597nm（5D0-7F2）、618nm（5D0-7F3），最大发射波长为597nm（5D0-7F2[13]），激发和发射光谱间没有重叠，stokes位移可达到277 nm，此Eu3+-螯合剂的荧光发射强度较高，发射峰尖锐。符合HTRF技术的分析要求。

图9 Eu3+-螯合剂的激发和荧光光谱

图10所示为Eu3+-螯合剂（化合物P4）的荧光衰减曲线，通过单指数拟合可知此Eu3+-螯合剂的荧光寿命为0.828ms，可以有效地避免本底荧光的干扰，符合HTRF的分析要求。

图10 Eu3+-螯合剂的荧光衰减曲线

量子产率Φ是所有处于激发态的稀土螯合剂经过辐射跃迁返回基态的分子个数与其总分子数的比值，一般用量子产率表达荧光螯合物的荧光发射强度，其值越大，强度越强，分析技术中一般要求荧光标记物的量子产率在0.1～1之间。该Eu3+-螯合剂的荧光量子产率为0.235（322nm氙灯激发），可以达到分析技术中的应用要求，Eu3+-螯合剂具有一定实际应用价值。

图11所示为Eu3+-螯合剂（化合物P4）浓度梯度曲线，最初配制的浓度为1.12×10-4mol/L的溶液，经稀释分别配成浓度为2.23×10-6mol/L、1.24×10-6mol/L、5.93×10-7mol/L、1.79×10-8mol/L进行浓度梯度检测，该螯合剂在水中的摩尔浓度与其相对荧光强度呈线性正相关，相关系数为0.995，而且即使在摩尔浓度很低时，仍具有很强的荧光强度。

图11 Eu3+-螯合剂的浓度梯度曲线

3 结论

本论文以2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯为原料经NBS溴化、酯水解等反应过程合成螯合剂2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2’-联吡啶-6，6’-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu3+，并通过1H NMR、IR、MS、DSC等表征方法对各配体及螯合剂的结构进行了确认，并对螯合剂的光谱性质进行了研究。结果表明：该螯合剂的激发光谱谱带较宽、最大激发波长为320nm，最大发射波长为597nm（5D0-7F2），激发光谱与荧光光谱间不重叠，荧光寿命高达828μs，荧光量子产率Φ为0.235。螯合剂在水中的摩尔浓度与其相对荧光强度呈正相关，相关系数为0.995，且在较低浓度下，该配体仍然具有很强的荧光强度，而且螯合剂具有较长的荧光寿命能够有效的避免背景荧光的干扰，达到了时间分辨荧光的效果。综上所述，该Eu3+-螯合剂可以满足HTRF的分析要求。