血细胞分析和血红蛋白电泳在黎族珠蛋白生成障碍性贫血筛查中的应用∗∗

胡俊杰，陈鑫苹#，王 洁，张继业，赵立强，李晓娟，徐卫华，余永娟，文海峰，文 书，李凌云，符生苗△

(1.海南省人民医院医学检验中心/海南省细胞与分子遗传转化医学重点实验室，海口 570311；2.海南省妇幼保健院检验中心，海口 570208；3.海南省白沙县人民医院检验科 571300；4.海南省昌江县人民医院检验科572700；5.海南省琼中县人民医院检验科 572900；6.海南省陵水县计划生育服务中心检验科 572400)

珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血，以下简称地贫)是由于珠蛋白基因缺陷，导致血红蛋白结构异常而发生的一种慢性溶血性单基因隐性遗传病，我国长江流域以南的广东、广西、四川、云南、贵州、湖南、江西、浙江、福建、海南等地均是地贫高发地区，其中两广及海南地区的地贫流行形势较为严峻[1-2]。黎族是海南省特有的少数民族，有研究显示海南黎族人群地贫基因携带率为56.94%[3]，汉族人群地贫基因携带率为14.95%[4]。随着分子生物学技术的发展，地贫基因检测有望取代血细胞分析和血红蛋白电泳而成为诊断地贫的金标准，但基因检测成本较高，同时对操作环境和技术人员要求较严格，而黎族地区地处多为偏远的山区，经济发展落后，医疗条件较差，地贫基因检测难于推广，所以血细胞分析和血红蛋白电泳依然是黎族地区筛查地贫的主要方法。本研究选取海南黎族地区的黎族和汉族中学生为调查对象，探讨大样本下地贫筛查中血细胞分析和血红蛋白电泳的临床应用价值，为黎族地区的地贫筛查提供有效依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年6月至2017年5月白沙、昌江、陵水、琼中、五指山等5个黎族市县，共7 615例中学生作为研究对象，其中黎族4 823例，汉族2 792例。采集静脉血3 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，4 ℃运输保存。

1.2 方法

1.2.1血细胞分析 采用五分类血细胞分析仪XE-2100(日本Sysmex公司)进行血细胞分析，筛查标准以红细胞平均体积(MCV)<82 fL或红细胞平均血红蛋白量(MCH)<27 pg为疑似地贫基因携带者。

1.2.2血红蛋白电泳 采用Cappilarys 2型全自动毛细管电泳分析仪(法国Sebia公司)及配套试剂和质控品，严格按照标准操作规程进行血红蛋白电泳检测。筛查以血红蛋白A(HbA)：96.5%～97.5%，血红蛋白A2(HbA2)：2.4～3.0%，血红蛋白F(HbF)：0～1.0%排除α，β地贫基因携带者。

1.2.3地贫基因检测 使用全血DNA提取试剂盒(北京天根生物技术公司)结合Smart-32核酸提取仪(广州中山大学达安基因股份有限公司)提取基因组DNA，使用PCR-流式荧光杂交法-地贫(α/β)基因检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)结合Luminex MAGPIX扫描仪(美国R&D系统公司)，定性检测α-地贫的3种缺失型(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3种突变型(WS122、QS125和CS142)及β-地贫的17种突变型(CD41-42、IVS-2-654、CD17、-28、CD26、CD71-72、CD43、-29、Int、CD14-15、CD27-28、-32、-30、IVS-1-1、IVS-1-5、CD31和Cap)。

1.2.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计数资料以例数或百分率表示，采用χ2检验对血细胞分析、血红蛋白电泳、联合检测的检出率及3种方法的灵敏度和特异度进行统计分析，以P<0.05为差异统计学意义。灵敏度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%，特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%。

2 结 果

2.1地贫基因检测结果 4 823例黎族研究对象中检测出地贫携带者3 041例，检出率为63.05%，其中α-地贫2 678例，占55.53%；β-地贫85例，占1.76%；α合并β地贫278例，占5.76%；正常者1 782例，占36.95%。2 792例汉族研究对象中检测出地贫携带者624例，检出率为22.35%，其中α-地贫548例，占19.63%；β-地贫51例，占1.83%；α合并β地贫25例，占0.90%；正常者2 168例，占77.65%，见表1。

表1 地贫基因检测结果

2.2单独检测和联合检测的检出率 黎族研究对象中血细胞分析地贫检出率为76.59%(2 329/3 041)，其中α-地贫检出率为74.64%(1 999/2 678)，β-地贫检出率为89.41%(76/85)；α合并β地贫检出率为91.37%(254/278)。血红蛋白电泳检测地贫检出率为79.05%(2 404/3 041)，其中α-地贫检出率为76.47%(2 048/2 678)；β-地贫检出率为96.47%(82/85)；α合并β地贫检出率为98.56%(274/278)。联合检测地贫检出率为99.41%(3 023/3 041)，其中α-地贫检出率为99.40%(2 662/2 678)；β-地贫检出率为98.82%(84/85)；α合并β地贫检出率为99.64%(277/278)，见表2。汉族研究对象中血细胞分析地贫检出率为70.19%(438/624)，其中α-地贫检出率为69.71%(382/548)；β-地贫检出率为68.63%(35/51)；α合并β地贫检出率为84.00%(21/25)。血红蛋白电泳检测地贫检出率为93.27%(582/624)，其中α-地贫检出率为94.52%(518/548)；β-地贫检出率为80.39%(41/51)；α合并β地贫检出率为92.00%(23/25)。联合检测地贫检出率为98.40%(614/624)，其中α-地贫检出率为98.54%(540/548)；β-地贫检出率为98.04%(50/51)；α合并β地贫检出率为96.00%(24/25)，见表3。

表2 黎族单独检测和联合检测的检出率

表3 汉族单独检测和联合检测的检出率

2.3单独检测和联合检测的灵敏度及特异度 黎族研究对象中血细胞分析的灵敏度为76.59%，特异度为74.54%；血红蛋白电泳的灵敏度为79.05%，特异度为63.31%；联合检测的灵敏度为99.41%，特异度为46.75%。汉族研究对象中血细胞分析的灵敏度为70.19%，特异度为71.82%；血红蛋白电泳的灵敏度为93.27%，特异度为54.01%；联合检测的灵敏度为98.40%，特异度为34.32%。黎族和汉族中联合检测的灵敏度均高于单独检测(P<0.01)，同时血红蛋白电泳的灵敏度均高于血细胞分析(P<0.01)。黎族和汉族对比分析显示，黎族血细胞分析的灵敏度高于汉族(P=0.001)，汉族血红蛋白电泳的灵敏度高于黎族(P<0.01)，联合检测中黎族、汉族间无明显差异(P=0.08)。黎族和汉族中联合检测的特异度均低于单独检测，且3种方法中黎族和汉族均以血细胞分析的特异度最高，此外黎族单独检测和联合检测的特异度均高于汉族(P<0.01)。

3 讨 论

目前临床上地贫的治疗主要基于长期输血和铁螯合治疗，此方法会产生许多并发症，且重型地贫患者往往会因无法治疗而死亡[5-6]，从社会经济和医疗资源角度分析，预防地贫患儿的出生比治疗更加重要。本研究中4 823例黎族人地贫基因携带率高达63.05%，表明黎族地区地贫流行状况十分严重，而地贫筛查是地贫诊断和制定预防措施的第一步，在黎族人群大样本量流行病学调查中的实际应用值得探讨。

轻型地贫和缺铁性贫血在临床上均表现为小细胞低色素性贫血，仅以MCV和MCH为判断指标往往不足以完全区分这两种疾病，容易造成地贫的误诊[7]。本研究中血细胞分析在黎族人群中筛查地贫的灵敏度为76.59%，特异度为74.54%，与郑琳等[8]在福建地区的研究结果存在一定差异，其中地理因素和研究人群的不同可能是主要原因。王英等[9]报道将MCV、MCH结合红细胞体积分布宽度(RDW)检测可以对缺铁性贫血和地贫进行初步鉴别，此外宋凤吉[10]研究也显示缺铁性贫血组的红细胞(RBC)和血红蛋白(Hb)均低于地贫组，但RDW高于地贫组。因此，为提高血细胞分析在地贫筛查中的灵敏度和特异度，可增加RBC、Hb和RDW等指标。

成年人正常Hb成分主要分为3类：HbA、HbA2、HbF，当α-地贫发生时α珠蛋白合成数量降低使得HbA2表达也降低，β-地贫发生时β珠蛋白合成数量降低使得HbA2或HbF表达增高，通过检测Hb成分变化可以判断地贫发生与否，以及地贫类型[11-12]。大多数实验室设置HbA2的正常范围为2.5%～3.5%，HbA2<2.5%初步判断为α-地贫，HbA2>3.5%初步判断为β-地贫，但不同地区及不同人群的HbA2参考值范围存在差异[13]。本研究将HbA2<2.4%初步判断为α-地贫，HbA2>3.0%初步判断为β-地贫，结果显示黎族和汉族人群血红蛋白电泳的灵敏度均高于各自的血细胞分析灵敏度，表明血红蛋白电泳在地贫筛查中表现较为优越。民族之间比较显示汉族血红蛋白电泳的灵敏度高于黎族(P<0.01)，但基因检测显示黎族地贫携带率高于汉族，表明初步设定的HbA2判断标准更适用于汉族人群。在β-地贫中黎族的血红蛋白电泳灵敏度高于汉族，结合汉族β-地贫携带率高于黎族(1.83%vs.1.76%)，表明利用HbA2值判断地贫类型需要区分民族，即黎族和汉族的Hb成分的参考标准有较大差异。此外，本研究中黎族和汉族血红蛋白电泳的特异度均较低，与张卫云等[14]报道用HbA2鉴别β-地贫的特异度达89.13%有较大差异。因此，海南地区的黎族和汉族人群Hb的各参考指标需要进一步优化以减小对特异度的影响。

杨梅[15]报道用联合检测方法检测地贫的灵敏度达81.67%，特异度达95.83%。本研究中联合检测虽然具有高的灵敏度(黎族为99.41%，汉族为98.40%)，但特异度(黎族为46.75%，汉族为34.32%)明显低于前者的研究结果，分析原因可能与前者研究样本量小，地贫携带率代表性不够有关，或本研究中设置的HbA2正常范围较小，导致地贫检测结果分析特异度降低。此外，本研究采用的地贫基因检测方法只能检测常见的23种地贫基因型，但结合联合检测结果发现存在血细胞分析和血红蛋白电泳结果与地贫基因检测结果不相符的异常黎族样本，可能超出此基因检测方法的检测范围但不能排除存在其他罕见或突变地贫基因型，需要用基因测序技术予以鉴定，所以联合检测结合基因检测技术在寻找新的基因突变方面具有较高的参考价值，为黎族地贫后期研究提供依据。