棉秆促腐菌剂包埋固定化及其应用效果研究

刘 刚，常贵慧，罗毅媚，李艳宾,2*

(1.塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300； 2.塔里木大学 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

新疆是我国棉花主产区，棉花种植面积与产量均居全国第一。受各方面因素所限，长期连作加以棉秆直接还田现象在新疆普遍存在，这带来了一系列连作障碍问题[1]。秸秆腐解物的化感作用是作物连作障碍的重要因素之一[2-4]，作物秸秆还田后，随着土壤中化感物质的累积，对作物的毒害作用逐渐加重[5]。同时化感物质在土壤微生物的作用下也可得到逐渐降解，而腐解物中能够促进作物生长的物质显著增加[6-7]，逐渐降低秸秆还田的化感作用。据此，在生产中可通过人工接种功能微生物菌剂来促进秸秆和化感物质降解以降低或消除化感作用[8-10]。

将微生物细胞进行固定化是提升功能微生物使用效果的有效手段[11-12]。固定化微生物菌剂可在土壤环境中形成优势菌群，增强其与土著菌的生态竞争，提高定殖能力[13-14]。目前，固定化技术已被广泛应用于生物肥料、环境保护、生物防治等领域。

近年来，塔里木大学应用微生物课题组针对棉花连作障碍，从棉秆还田的化感效应角度展开了一些研究，筛选获得一些可降低棉秆自毒作用的菌种，证实接种菌剂人工促腐棉秆可有效消除棉秆腐解物对棉花种子萌发及幼苗生长的抑制作用，且能降低腐解物中主要化感物质的浓度[15-16]。本研究在前期筛选所得棉秆促腐菌种的基础上，开展了菌剂的包埋固定化研究，检验其对棉花生长的影响，以期提高其应用效果，为棉秆促腐菌剂合适剂型的开发与应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试棉花品种为新陆中-42，从新疆阿拉尔附近棉田采集棉秆，风干后粉碎至2 cm左右。供试促腐菌剂为课题组前期研究所用的复合菌剂，包括黄孢原毛平革菌和斜卧青霉2种真菌[15-16]。

1.2 培养基

菌种活化采用PDA培养基。

发酵培养基：棉秆与麸皮按6∶4比例混匀，调节C/N为25∶1，将含水率调至70%，拌匀后121 ℃灭菌30 min。

1.3 棉秆促腐菌固定化菌剂制备

1.3.1 促腐菌孢子发酵生产 利用固态发酵的方式，将活化好的促腐菌种接至发酵培养基中，30 ℃下培养，待长满孢子后用无菌水洗脱，得到孢子悬液，经6 000 r/min离心20 min后收集孢子。

1.3.2 促腐菌孢子的包埋固定化 参照韩梅等[14]报道的方法，选取海藻酸钠(SA)和聚乙烯醇(PVA)为包埋剂，用蒸馏水配制成两者含量均为3%的混合液，121 ℃灭菌20 min，冷却至35 ℃后，按1 g湿孢子加入10 mL溶液的比例将孢子加入到以上包埋剂溶液中，恒温磁力搅拌器混合均匀后，用注射器均匀滴加到20 mL含3% CaCl2的饱和硼酸溶液中交联24 h，收集颗粒，用生理盐水和无菌水洗涤数次，4 ℃保藏备用。

1.4 固定化菌剂应用效果检验

1.4.1 固定化菌剂施用对棉花生长的影响 采用盆栽法进行菌剂效果检验。将棉田土壤装至盆钵，每千克土混入20 g粉碎后的棉秆。按土壤质量设置施入固定化菌剂20 g/kg(IM20)、40 g/kg(IM40)、60 g/kg(IM60)3个用量水平，每个水平5次重复。同时制备不含菌种(IM0)的包埋剂颗粒作为对照(CK)，并与未经固定化的促腐菌剂(FM)作对比，孢子浓度为108个/mL，土壤中接种量为10 mL/kg。播入经消毒催芽的棉花种子，每盆10粒，于25 ℃下进行培养，每天光照14 h，光照强度为4 000 lx。每7 d喷施霍格兰营养液100 mL，期间每2～3 d浇水一次，30 d后测定棉花幼苗的形态和生理指标。棉花幼苗形态指标采用常规方法测定；根系活力、叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、丙二醇(MDA)含量等生理指标按李合生[17]的方法测定。

1.4.2 棉花根际土壤中主要化学成分的测定 取各处理土样200 g于蒸馏瓶中，按2倍体积加入纯净水，放置在加热套中加热蒸馏1 h(接冷凝管，收集冷凝液)，将得到的冷凝液依次用等量乙醚、乙酸乙酯萃取12 h，所得乙醚相、乙酸乙酯相在37 ℃下减压浓缩至20 mL，并用无水硫酸钠脱水后，分别用气相色谱-质谱方法(GC-MS)进行化学成分分析，GC-MS条件参照课题组前期研究所用的条件[15]。应用NIST 98质谱数据库检索进行未知物的鉴定。

1.5 数据分析

试验数据用Excel 2010和DPS 7.05统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 施用固定化棉秆促腐菌剂对棉花幼苗生长的影响

2.1.1 棉花幼苗形态特征 以施加不含菌种的包埋剂颗粒为对照，检测了不同固定化促腐菌剂施用量对棉花幼苗株高、根长、植株干质量和根干质量的影响，并与施加未经固定化的促腐菌孢子悬液作对比，结果如表1所示。

从表1可以看出，与CK相比，施用促腐菌剂可以不同程度促进棉花幼苗的生长。IM40处理、IM20处理的株高、植株干质量均极显著高于CK(P<0.01)，其中IM40处理的株高为12.64 cm，植株干质量为219.77 mg，相比CK增幅分别达到57.21%、61.54%，说明促腐菌剂的施用一定程度促进了棉花的生长。但IM60处理的株高和植株干质量相比IM40、IM20处理反而极显著降低(P<0.01)，可能是由于菌剂量过大，微生物在生长过程中消耗掉土壤中过多的养分，给棉花的生长带来不利影响。棉花幼苗根的生长情况类似，随着固定化菌剂施用量的增加，其根长和根干质量逐渐降低，施用量为20 g/kg时，棉花的根长和根干质量较高，分别为5.93 cm、104.45 mg，到60 g/kg的用量时，根长和根干质量仅为4.99 cm、77.05 mg，其中根干质量与IM20处理相比降低程度达极显著水平(P<0.01)。据此分析，采用菌剂促腐棉秆可有效缓解棉秆还田的不利影响，促进棉花生长，但需要控制好菌剂的用量。从本试验所设置的处理来看，施用20～40 g/kg的固定化菌剂效果较好，虽然棉花根长和干质量较未固定菌剂处理(FM)低，但对植株整体生物量影响不大，说明菌剂固定化对根吸收养分的活力没有不利影响。

表1 不同用量固定化促腐菌剂对棉花幼苗生长的影响

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)，下同。

2.1.2 棉花幼苗生理特性 从表2可以看出，施用固定化促腐菌剂后，棉花幼苗植株体内的保护酶SOD与POD活性相比CK降低，反映细胞膜伤害程度的MDA含量也极显著低于CK(P<0.01)。由此可以推断，施用固定化促腐菌剂，有效缓解了还田棉秆降解过程对棉花生长造成的胁迫，使棉花幼苗具有较好的生理状态。FM的棉花植株中MDA含量相比CK也显著降低(P<0.05)，但高于各固定化菌剂处理，其中比IM20、IM40两处理植株中的MDA含量分别高出91.71%、45.65%。此外，固定化菌剂施用剂量同样对棉花植株生理活性有较大影响，棉花植株中的MDA含量随着菌剂用量的增加而逐渐升高，而叶片中叶绿素的含量在逐渐降低。IM20处理植株叶片中叶绿素含量为76.37 mg/kg，极显著高于其他处理(P<0.01)，而菌剂用量达到60 g/kg时，植株叶绿素含量仅为32.73 mg/kg，甚至远低于CK(53.91 mg/kg)(P<0.01)，这再次说明菌剂的用量是施用固定化菌剂促腐棉秆的关键。各处理中棉花的根系活力没有显著差异，但3个固定化菌剂处理的根系活力相比CK和FM有一定幅度的增高。IM60处理下根的生长虽然受到一定抑制(表1)，但高的根系活力依然较好地维持了植株的生长。

综上分析，施用促腐菌剂能一定程度解除棉花所受的胁迫，使幼苗维持在较健康的生理状态。施用20～40 g/kg的固定化菌剂，可有效缓解还田棉秆的自毒作用，保证棉花幼苗具有较好的生长状态，且比未固定化菌剂的效果好。

表2 不同用量固定化促腐菌剂对棉花幼苗生理指标的影响

2.2 施用固定化棉秆促腐菌剂对棉花根际土壤化学成分的影响

待盆栽试验结束后，取各处理土样分别经乙醚、乙酸乙酯萃取，用GC-MS测定其中的化学成分。结果表明，各处理土样中均鉴定出30余种化合物，不同处理土样的化学成分种类与含量有较大的差异，各土样乙醚、乙酸乙酯萃取相中主要的差异化合物见表3、表4。

表3 各处理土样乙醚萃取相中主要差异化合物的种类与含量

表4 各处理土样乙酸乙酯萃取相中主要差异化合物的种类与含量

从表3、表4可以看出，CK与其余处理间，乙醚萃取相中成分变化较大的化合物有4种，乙酸乙酯相中成分变化较大的化合物有6种。其中多数成分的含量在施用固定化菌剂的处理中有所降低，如二苯胺、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯等，而这些成分已在其他相关研究中被报道为化感物质[15,18-20]，这说明促腐菌剂的施入可一定程度降低土壤中化感物质的量，减轻棉秆还田后棉花生长所受到的化感胁迫。此外，这几种化合物含量的变化，与菌剂类型、施用量的关系总体表现出一致的规律。在未经固定化菌剂的处理中，这些化合物的含量降低幅度相对较小，甚至邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯还有小幅度升高。固定化菌剂的施用量对化合物含量的影响也较大，随着施用量的增大，这几种化合物的含量整体呈现出先降低后升高的趋势。再次印证固定化促腐菌剂的施用量是降低棉花生长过程中所受化感胁迫的关键。总的来看，IM40处理土壤中几种化感物质的含量最低，其中二苯胺、邻苯二甲酸二丁酯的含量分别为0、1.6%，CK中的含量分别为17.0%、3.1%；邻苯二甲酸二异丁酯的含量为49.5%，CK中为69.8%，降低20.3个百分点；邻苯二甲酸二异辛酯的含量为1.2%，CK中为8.1%，降低6.9个百分点。

3 结论与讨论

长期连作所引起的病害加重、微生物群落失衡、土壤理化性状改变等连作障碍问题，是影响我国棉花产业健康可持续发展的重要因素[21]。特别是同时实施秸秆还田的作物，连作障碍现象更为突显[22]。秸秆还田是补充土壤肥力的重要手段，但通常秸秆腐解缓慢难以快速成肥，加上化感物质逐渐积累而带来自毒作用，往往使得作物连作障碍逐年加重[10]。大量研究表明，某些微生物不但能有效腐解秸秆、改善土壤理化性质[23-24]，有的还能降解土壤中常见的化感物质[8-10]，或对土传病菌具有较强的拮抗效果[25-26]，因此，接种外源微生物来促腐秸秆被认为是有效降低秸秆还田化感作用的方法。塔里木大学应用微生物课题组前期研究结果也表明，通过接种棉秆降解微生物人工腐解棉秆，在30 d以上能有效消除棉秆腐解物对棉花种子萌发及幼苗生长的抑制作用[15-16]。

在土壤有害物质生物降解、秸秆促腐等有关研究中，将微生物或酶进行固定化是常用的手段之一[11-12,27-28]，包埋法是土壤修复应用中微生物固定化的主要方法，常用的包埋剂有海藻酸钠、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等[28]。功能微生物在固定化材料颗粒内部富集生长，形成优势菌群，可以克服外部环境条件以及土著微生物的不利影响，促进功能微生物成功定殖，有效提升其竞争力[14,28]。本研究以海藻酸钠和聚乙烯醇为包埋剂，在棉秆还田模式下检验固定化棉秆促腐菌剂对棉花生长的影响，结果表明，施用固定化促腐菌剂能一定程度缓解棉花所受的胁迫，使幼苗维持在较健康的生理状态，同时土壤中一些主要的化感物质也得到了有效降解。这需要控制好菌剂的施用量，在本试验中施用20～40 g/kg的菌剂效果较好，与不施菌剂对照处理和施用未固定化菌剂处理相比，棉花幼苗的生长状态和生理活性均有显著提升，土壤中几种主要化感物质的含量大幅降低。菌剂施用量过高(60 g/kg)反而会影响实际应用效果，甚至产生一定的负作用，表现在化感物质成分得不到有效降解，对棉花幼苗的生长没有促进甚至有一定程度的抑制等。本研究所选取的固定化菌剂施用量梯度较少，在今后的研究中需对菌剂施用量做进一步探讨，以便选出最佳的固定化菌剂施用量。