siRNA沉默HOTAIR表达对人胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

郭志钢,王 涵,王 冠,李妍哲,田 宇,李朝晖*

(1.吉林大学中日联谊医院 神经外二科，吉林 长春130033； 2.长春中医药大学附属医院 检验科，吉林 长春130010)

HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是一种典型的反义长链非编码RNA(long noncoding RNA,IncRNA)，其在多种肿瘤中表达异常增高。HOTAIR在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移中发挥重要的作用[1-3]。有研究发现，胶质瘤中HOTAIR呈高表达，但在胶质瘤中的作用机制尚不明确[4]。本研究通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制胶质瘤细胞A172中HOTAIR的表达，观察HOTAIR下调后对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响，进一步揭示HOTAIR在胶质瘤中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

DMEM培养基购于南京凯基生物科技发展有限公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，DMSO和MTT购自杭州昊天生物公司，Ultra SYBR荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。细胞周期DNA含量检测试剂盒和Lipofectamine2000购自南京凯基生物技术股份有限公司。

1.2细胞培养

人胶质瘤细胞A172和人星形胶质细胞HA1800均购自中科院上海细胞所。A172细胞和HA1800细胞培养于含青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL 、10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃和5%CO2的培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。取对数生长期的细胞用于实验。

1.3荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)

Trizol试剂提取总RNA。检测RNA浓度，HiFi-MMLV cDNA试剂盒合成第一链cDNA。

逆转录产物用SYBR试剂盒进行荧光定量PCR反应，β-actin作为内参基因。 HOTAIR引物，上游：5’- CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3’，下游：5’-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3’。β-actin引物，上游：5’-GGCACCACACCTTCTACAAT-3’，下游：5’-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3’。real-time PCR反应条件：95℃，10 min；94℃，30 s， 58℃，30 s，72℃，60 s，40个循环；72℃，10min。qRT-PCR结果利用2-△△Ct法进行计算分析。

1.4si-HOTAIR转染

si-HOTAIR序列为5’-GCGCCUUCCUUAUAAGUAUTT-3’，阴性对照(negative control,NC)序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。Lipofectamine 2000 试剂转染，qRT-PCR方法检测转染效率。实验分si-HOTAIR组、NC组及空白对照组(Blank)。

1.5MTT法检测细胞增殖率

取对数生长期的细胞，以2×104/ml的密度接种在96孔培养板上，每孔100 μl。细胞增至50%-60%时转染siRNA，培养箱中继续培养。采用MTT法测定细胞生长活性，以570 nm波长吸光度OD值表示，计算细胞增殖率。细胞增殖率=处理组OD值/对照组OD值。

1.6Guava微流式细胞分析仪检测细胞周期

收集细胞，用PBS洗涤，加入700 mL/L乙醇1 ml，固定过夜。第2 天离心去除乙醇，以含2 g/L PI的PBS 500 μl重悬，避光继续孵育30 min，过200目细胞筛后。利用Guava easy Cyte 8微流式细胞分析仪检测细胞周期。

1.7Transwell实验检测细胞的侵袭能力

无血清培养基以8∶1的比例稀释Matrigel胶，均匀铺于Transwell小室，每孔50 μl，37℃反应30 min。各组细胞以5×104个/孔接种于Transwell小室，在含5%CO2的培养箱中37℃连续培养24 h。用湿棉棒擦去上室底部膜表面上的细胞，然后揭下底部膜，底部向上晾干。最后移至载玻片上，用中性树胶封片。显微镜下随机取9个视野计数，统计结果。

1.8统计学方法

2 结果

2.1HOTAIR在胶质瘤细胞及正常胶质细胞中的表达分析

qRT-PCR方法检测正常星形胶质细胞HA1800和胶质瘤细胞A172中HOTAIR mRNA的相对表达量。检测结果显示，HOTAIR mRNA在HA1800和A172中的表达量分别为1.12±0.08和2.67±0.03，胶质瘤细胞中HOTAIR表达较正常星形胶质细胞显著增加(P<0.01，图1)。

2.2胶质瘤细胞A172中si-HOTAIR瞬时转染效率检测

利用qRT-PCR检测转染24 h、48 h及72 h后HOTAIR mRNA的表达水平，以验证转染si-HOTAIR后A172细胞中HOTAIR基因表达的抑制情况。结果显示，NC组与Blank组相比无统计学差异，si-HOTAIR组与NC组相比较，转染24 h、48 h及72 h后A172细胞中HOTAIR mRNA的表达水平分别下降(38.27±3.52)%、(70.16±0.57)%和(81.54±0.41)%，有显著性差异(P<0.01，图2)。结果说明si-HOTAIR转染显著降低细胞中内源表达的HOTAIR，可用于后续实验研究。

2.3MTT法检测si-HOTAIR对A172胶质瘤细胞增殖的影响

MTT结果发现，NC组与Blank组相比，转染24 h、48 h和72 h后细胞增殖率均无明显变化(P>0.05)。si-HOTAIR组与Blank组相比，在转染24 h后细胞增殖率无明显变化(P>0.05)，在转染48 h和72 h后细胞增殖率分别下降(15.38±0.39)%(P<0.05)和(27.54±2.32)%(P<0.01)，有统计学意义(图3)。

图1HOTAIR在A172和HA1800中的表达结果图2siHOTAIR瞬时转染A172细胞后HOTAIR的表达情况图3HOTAIR表达量降低对A172胶质瘤细胞增殖的影响

2.4流式细胞术检测si-HOTAIR对胶质瘤细胞A172细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，转染si-HOTAIR后，胶质瘤A172细胞中G0/G1期细胞逐渐增加，S期相对减少，且这一效果随着时间的延长更加显著(图4)。结果表明，si-HOTAIR能够抑制胶质瘤细胞从G0/G1期向S期转变。

2.5Transwell检测si-HOTAIR对A172胶质瘤细胞侵袭的影响

收集si-HOTAIR转染48 h后的A172细胞，转移至Transwell小室继续培养24 h，固定染色，显微镜下观察。si-HOTAIR组穿过小室基底膜的紫色细胞数量明显少于NC组及Blank组(图5)。取9个随机视野计数，结果显示，Blank组、NC组及si-HOTAIR组的穿膜细胞数分别为76.8±2.4、71.2±5.6和36.1±1.5，具有显著统计学差异(P<0.01)，si-HOTAIR组细胞侵袭能力显著低于Blank组及NC组。结果表明，si-HOTAIR能够降低胶质瘤细胞的侵袭能力。

3 讨论

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，尽管其治疗已发展为手术、放疗和化疗相结合的综合治疗模式，预后仍极差，其中胶质母细胞瘤的中位生存期仅为14.6个月[5]。因此，更加深入的研究胶质瘤的发病机制是亟待解决的问题。越来越多的研究表明，IncRNA参与胶质瘤的发生发展过程，IncRNA可通过调节DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构等多种途径，在胶质瘤的发病机制中扮演重要角色[6]。

HOTAIR是一种典型的IncRNA，也是第一个被发现具有反式转录作用的IncRNA，基因位于人类染色体12q13.13区同源框基因家族Hoxc11基因座的反义链。HOTAIR的生物学作用是通过募集一系列复杂蛋白复合体实现对下游靶标癌基因和抑癌基因的调控，主要功能体现在调节蛋白编码基因的表观遗传，如调节H3K27me3组蛋白的修饰、调节PTEN基因启动子区域的甲基化水平[7]。HOTAIR在乳腺癌、多发性骨髓瘤、肝癌等多种肿瘤的增殖、侵袭及转移中发挥重要作用，并且与临床预后密切相关[8,9]。

图4 HOTAIR表达量降低对细胞周期的影响

图5 si-HOTAIR转染后A172细胞侵袭能力检测

HOTAIR在胶质瘤中发挥的具体作用目前尚不清楚，本研究通过体外细胞实验，对HOTAIR在胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用进行探讨。首先利用qRT-PCR检测到HOTAIR在胶质瘤细胞A172中的表达水平较正常星形胶质细胞HA1800中明显增高。为进一步明确HOTAIR在胶质瘤增殖和侵袭中的作用，我们采用siRNA沉默基因表达的方法，合成si-HOTAIR，利用脂质体瞬时转染法转染至A172细胞，qRT-PCR方法验证si-HOTAIR可以明显下调HOTAIR的表达水平。采用MTT法、流式细胞术和Transwell侵袭实验分别检测抑制HOTAIR的表达对人胶质瘤A172细胞增殖、周期及侵袭能力的影响。MTT结果发现，HOTAIR表达下调的A172胶质瘤细胞增殖明显受到抑制，细胞周期实验发现下调HOTAIR表达可以阻滞胶质瘤细胞从G0/G1期向S期转换，同时，Transwell实验结果发现HOTAIR表达下调后A172细胞的侵袭能力明显降低。

本研究结果表明，下调HOTAIR表达能够抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，HOTAIR有望成为胶质瘤基因治疗的潜在靶点。