“探究pH对酶活性影响”实验的拓展

王永梅 张 锋

(1 福建省漳州市第一中学 漳州 363000； 2 福建省普通教育教学研究室 福州 350003)

1 引言

“探究影响酶活性的因素”是人教版高中生物学必修1第5章第1节第2课时的内容。该实验一方面可加深学生对酶作用和酶本质的深入理解，同时也为光合作用和呼吸作用的学习做知识和实验探究的铺垫。在完成教材实验后，学生提出一些在探究实验中产生的疑问： 如何使肝脏研磨液中的酶活性保持更久？在中学现有条件下，有没有较为简便的方法能达到多设几个pH梯度的目的？是否有其他快速简便检测影响酶活性因素的方法？围绕这些问题，教师引导学生进行进一步的探索。将高中生物学拓展实验中固定化酶技术、逐级稀释法等应用于该实验，并在此基础上应用尿糖试纸进行pH对酶活性影响的实验探究。

2 实验原理与方法

2.1 肝脏过氧化氢酶固定 固定化酶技术是通过化学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固定态的水不溶载体相结合或被载体包埋。传统的固定化酶技术可分为吸附法、共价键结合法、交联法、包埋法。本实验运用吸附法固定肝脏过氧化氢酶。将干净、干燥的滤纸片放入洁净托盘，倒入新鲜肝脏研磨液，静置一段时间后取出滤纸晾干，剪成4cm×4cm大小备用。

2.2 逐级稀释法配置HCl和NaOH溶液 实验需要配置不同pH的酸碱溶液。该过程操作繁琐。借用化学试剂配制的逐级稀释法可极大简化操作。分别以100mL的5%HCl和10%NaOH为母液；取10mL母液，加入90mL蒸馏水，配制成稀释10倍的B试液；再取10mL B试液稀释到100mL，配制成稀释100倍的C试液(由于未配置pH计，采用pH试纸进行测定，结果显示试液pH呈现明显的梯度变化)。

2.3 市售尿糖试纸 尿糖试纸是采用固定化酶技术制成的商品化产品，用来检查尿糖患者尿糖情况的专用试纸。根据葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下形成葡萄糖酸和过氧化氢，H2O2在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧，以及原子氧可以将某种无色的化合物氧化成有色的化合物的原理，将上述两种酶和无色化合物固定在纸条上，制成测试尿糖含量的酶试纸。商品化的尿糖试纸购买方便，均一性强，批次间差异小，可用于替代含新鲜肝脏研磨液的滤纸片。

3 结果与分析

3.1 固定化酶技术在探究pH对过氧化氢酶活性影响实验中的应用 先将等面积的含酶滤纸片分别放入相应梯度pH试液及蒸馏水中处理相同时间(5min)，夹出转移至对应的洁净培养皿中，往上面滴加等量3% H2O2溶液，1min后观察产生气泡的量并记录。

表1 梯度pH条件下的过氧化氢酶活性检测

(注： -代表没气泡，+表述产生气泡的量)

结果显示(表1)，5%HCl处理组没有气泡产生(记为“-”)；蒸馏水处理组有大量气泡产生(记为“++++”)；10%NaOH处理组有少量气泡产生(记为“+”)。由此可见酸或碱会极大影响过氧化氢酶的活性，酸对过氧化氢酶的影响大于碱。

取室温保存2d和7d的含酶滤纸片做酶活性的对比实验，发现两者都产生大量气泡，说明含酶滤纸片室温(福建9月的平均气温在37℃以上)保存一周仍具有较高活性。

3.2 逐级稀释法配置不同pH梯度的HCl和NaOH溶液 运用逐级稀释法对质量分数为0.1g/mL的NaOH和体积分数为5%的HCl进行10倍倍比稀释，用pH试纸进行测定，与标准比色图谱比较，记录结果(表2)。

表2 逐级稀释法配置不同pH梯度溶液的可行性研究

通过逐级稀释，溶液pH确实呈现梯度变化，借助此方法可轻松准确配置一系列pH梯度的溶液，解决配液难的问题。

3.3 尿糖试纸检测pH对过氧化氢酶活性影响实验 尿糖试纸上吸附有过氧化氢酶。未使用的尿糖试纸是淡蓝色的。10个小烧杯中，各加入1mL 3% H2O2溶液，按照表3加入对应滴数的5% HCl和5% NaOH，摇匀后将尿糖试纸放入，30s后取出，与瓶签上的标准比色图谱比较，记录结果(表3)。

表3 尿糖试纸替代含酶滤纸片的初步研究

(注：“+”越多，棕色越深，说明酶活性越高；“-”代表没反应，说明酶活性丧失)

若反应体系中有氧气产生，则试纸转变为棕色，棕色越深，代表氧气产生量越大，过氧化氢酶的酶活性越高。试纸显色结果明显显示出加入不同滴数的酸溶液或碱溶液对过氧化氢酶活性的影响。加入3滴5% HCl后基本没有反应，酶活性变化很大。5% NaOH溶液对酶活影响较酸小很多，但也能明显影响酶活性。这与含酶滤纸片进行的实验结果相吻合，说明尿糖试纸的替代性使用是可行的。

4 讨论

含酶滤纸片制备简单方便、快捷、均一性良好，保存简单。用于教材实验效果显著，免去溶液混合的步骤，保证实验在预设pH下进行，有效控制单一变量。整个实验在滤纸片上进行，避免手部直接接触强酸强碱，安全性高。保存7d的滤纸片一开始产生气泡的速度较慢，但不影响整体实验结果的判断，可以较好满足班级多、实验周期长的需求。

商品化的尿糖试纸购买方便，价格实惠，均一性强，批次间差异小，可用于替代含新鲜肝脏研磨液的滤纸片，省去购买肝脏、制备研磨液、制备含新鲜肝脏研磨液的滤纸片等步骤，买来即可使用，2～3min出结果，简化操作。尿糖试纸的使用，将原实验气泡的观察，转变为比色，更加直观。由于反应体系小，通过优化操作，让实验更加科学。通过实验，笔者发现过氧化氢酶的活性较容易受到酸性条件的影响，而在碱性条件下能保持较高活性，推测过氧化氢酶的最适pH偏碱。

在此基础上，引导学生利用已经梯度稀释的酸碱和H2O2溶液进行不同pH条件下酶活性的探究，小组内成员合作，短时间内完成多个梯度pH下酶活性的探究。不同小组间平行重复实验，几分钟内便可得到大批准确的实验结果，极大提高了课堂效率。学生通过操作体验学习到课本以外的科学方法，丰富了知识，提高了实验技能。