弓形虫生物检测靶标miR-191的鉴定

温福利, 郑和平, 党 源, 薛来恩, 赵东岳,2

(1. 南京军区福州总医院比较医学科, 福州 350025;2. 福建师范大学生命科学学院, 福州 350001)

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，是少数可穿越胎盘的病原体之一，人类及其他温血脊椎动物均可感染[1]。病原学分离和培养是弓形虫检测的金标准，但费时费力。免疫学检测易造成误诊或漏诊，存在假阳性和假阴性的缺陷[2]。核酸检测具有较高的特异性和敏感性，适用于弓形虫病的早期诊断。microRNAs (miRNAs)在弓形虫不同生活史中具有保守性，同时不易被Rnase降解，具有结构稳定性[3]。本研究利用高通量测序技术筛选出不同宿主来源弓形虫虫株高表达的miRNAs，并结合纳米金银染增强技术建立了一种简单、快速、灵敏的miRNA探针检测法，为弓形虫病的诊疗及预后判断提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物饲养与分组

清洁级雄性Wistar大鼠60只，体质量(200±20) g，分为模型组和对照组; 清洁级雄性BALB/c小鼠60只，体质量(20±2) g，分为弓形虫RH株、弓形虫ME49株、伯氏疟原虫、约氏疟原虫、隐孢子虫、鼠肝炎病毒和金黄色葡萄球菌模型组和对照组。实验动物均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2017-0005]，按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 材料与试剂

弓形虫RH株、弓形虫ME49株、伯氏疟原虫、约氏疟原虫、隐孢子虫，鼠肝炎病毒和金黄色葡萄球菌由兰州兽医研究所和福建师范大学寄生虫研究室提供。15 nm纳米金购自Sino-American Biotechnology公司，核酸序列、氯仿、异丙醇、体积分数75%乙醇、焦碳酸二乙酯、酶标板、柠檬酸、硝酸银、柠檬酸三钠及氢醌均购自生物工程(上海)有限公司。所有烷巯基标记的核苷酸溶解于TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.4)。

1.3 纳米金探针miR-191诊断效能的研究

利用四种不同探针定量高表达的miR-191： Seq1是带生物素标记的捕获探针，能和miRNAs互补结合; seq2是纳米金标记的信号探针，也能特异地和miRNAs互补结合；而seq3和seq4分别是除一个核苷酸错配外其余序列与seq1和seq2相同的生物素和纳米金探针。通过碱基互补配对结合靶miRNAs成杂交双链，经链酶亲和素生物素系统识别将纳米金信号锚定在酶标板上，然后通过银染增强放大纳米金信号，从而实现不同基因型弓形虫虫株miRNA的定量与检测[酶标仪检测630 nm处吸光度值(A)]。用捕获探针和信号探针及其突变1个碱基的捕获探针和信号探针分别验证各个稀释浓度(1 fmol/L～1 nmol/L)中不同基因型弓形虫虫株靶标miR-191敏感性和探针特异性，并用工作者受试曲线(ROC)曲线分析弓形虫miRNA的诊断效能。miR-191及四种探针信息如下：

1.4 外周血靶标miR-191不同时间的定量研究

弓形虫强弱毒株分别感染大鼠，制作慢性弓形虫感染模型。采集的动物样本用Trizol方法提取总RNA。根据靶标miR-191制备的纳米金探针来验证不同时间(0 d、1 d、3 d、5 d、7 d)靶miRNA在血液的定量，研究是否具备生物检测靶标miRNA的潜在性。

1.5 弓形虫靶标miR-191在小鼠模型中的验证

制作弓形虫RH株、弓形虫ME49株、伯氏疟原虫、约氏疟原虫、隐孢子虫，鼠肝炎病毒和金黄色葡萄球菌感染的小鼠模型，依次检测miRNA表达情况，采用Mann-Whitney检验对靶标miRNA的特异性进行验证。

2 结果

2.1 弓形虫靶标miR-191敏感性分析

合成miR-191序列后稀释成不同的浓度(从1 fmol/L～1 nmol/L), miR-191的最低定量是101fmol/L,从10 pmol/L到10 fmol/L, 靶miRNA浓度的对数值与A值之间具有很好的线性关系(图1)，经线性回归分析得出R2＝0.990 6。miR-191浓度(mol/L)的对数值作为自变量，A值作为因变量，用直线回归方法对以上浓度与效应关系曲线得到拟合方程： y ＝ 0.061 9x+0.909 2(y： 溶液的A值，x：目的序列的浓度的对数值)。

2.2 纳米金探针的特异性分析

检测miR-191的纳米金探针具有高度特异性，纳米金探针在miR-191浓度低至10 fmol/L 浓度水平，用本方法能够检测出单核苷酸错配序列间的差异(图2)。

图1 靶miRNAs浓度的对数值与A值之间的线性关系Figure 1 Linear relationship between the numerical value of miRNAs concentration and A value

图2 四组不同探针在不同浓度范围内检测miR-191Figure 2 Four different probes were used to detect miR-191 in different concentration

图3 弓形虫虫株的miR-191在感染小鼠血液中的验证Figure 3 miR-191 was validated in the blood of mice infected with Toxoplasma gondii

2.3 miR-191诊断效能研究

通过Mann-Whitney检验分析, 感染弓形虫小鼠血液中miR-191的表达量与对照组相比发生显著上调(P＜0.001)(图3)。感染RH株小鼠与正常小鼠的ROC曲线分析miR-191的曲线下面积(AUC)为0.943[95%置信区间(CI), 0.761～0.940]，敏感性71%，特异性100%(图4), 感染弓形虫M49株小鼠与正常小鼠相比曲线下面积(AUC)为0.954(95%CI, 0.892～0.996)，敏感性82%和特异性100%(图4)。

2.4 外周血靶标miRNAs不同时间的定量研究

在不同时间点对感染RH株和ME49株大鼠的血液靶标miR-191进行定量分析表明，miR-191在感染后的内表达较稳定，没有显著性差异(图5)。对不同时间点大鼠感染弓形虫情况检测后表明，感染后7 d内染虫情况相对稳定。

图4 ROC曲线分析感染弓形虫小鼠血液中miR-191的诊断效能Figure 4 The diagnostic efficiency of miR-191 in blood of Toxoplasma gondii infected mice was analyzed by ROC curve

图5 miR-191在感染弓形虫RH株和ME49株大鼠血浆样本中不同时间点的定量水平Figure 5 The quantitative level of miR-191 in plasma samples of Toxoplasma gondii RH strain and ME49 strain rat at different time points

2.5 弓形虫miRNAs在小鼠模型中的验证

miR-191在感染弓形虫RH株、弓形虫ME49株、伯氏疟原虫、约氏疟原虫、隐孢子虫, 鼠肝炎病毒和金黄色葡萄球菌的小鼠模型中依次验证其表达情况。通过Mann-Whitney检验分析表明，与对照组相比，miR-191在感染弓形虫 RH株和ME49株的小鼠模型中出现高表达，而在感染细菌、病毒和其它寄生虫的小鼠模型中均未出现表达(图6)。

3 讨论

弓形虫被认为是最成功的人类寄生虫，已感染全球近三分之一人口[4,5]。在临床中常采用免疫学方法进行检查，弓形虫IgM阳性，提示近期感染。弓形虫IgG阳性，提示既往感染。因缺乏统一的诊断标准，检查结果易出现假阳性或假阴性，让受检者进行有害治疗或延误治疗[2]。目前，弓形虫免疫学的诊断方法还不够可靠，诊断标准还有待完善[6]，建立敏感和特异的诊断方法仍是当前弓形虫的研究热点之一。

图6 miR-191在感染多种疾病小鼠血浆样本中的验证Figure 6 The miR-191 was validated in the plasma samples of mice infected with various diseases

miRNAs 是作为真核生物非编码小RNA中一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，能够与靶mRNA的3’末端非编码区(UTR)、编码区或者 5’末端非编码区结合抑制mRNAs翻译或降解，从而完成转录后基因调控的使命[7]。弓形虫的生活史十分复杂，其生命周期的完成以及对生活环境的适应都依赖于精确的基因调控系统，因此miRNAs作为一类基因的调控因子，其存在性对弓形虫尤为重要[8,9]。通常编码miRNAs的基因在基因组上的位置为内含子、外显子及基因间区, 但是基因间区最常出现的位置, 以单拷贝、多拷贝以及基因簇的形式存在[3]。寄生原虫与真核生物一样具有能编码大量基因的基因组, 并且miRNAs对寄生原虫复杂生活史以及对不同环境的生存和进化具有重要意义[10]。

目前, 已有关于弓形虫miRNA检测方法的相关研究, 但还有待完善。王洁琳等[11]对弓形虫RH和ME49两个基因型弓形虫的miRNA进行了表达差异性分析, 结果表明，RH株和ME49株弓形虫分别有155个和20个miRNA上调表达。Jia等[12]研究表明，在感染弓形虫 RH 株和ME49 株的小鼠血浆中具有3个高表达和2个低表达的miRNA。何文蕾等[13]建立了基于银染增强的纳米金探针，定量检测了小鼠肝脏和脑组织中miR-122a和miR-128的表达。本文利用Solexa高通量测序技术筛选出不同弓形虫虫株之间表达量高且差异不明显潜在靶标，通过对弓形虫miR-191诊断效能和定量表达情况进行分析后,确认了其作为检测靶标的应用价值，这为继续研究其它生物检测靶标奠定了坚实基础，同时为研发基于核酸的弓形虫病快速检测试剂盒提供了新思路。