微电解水用于SPF级实验动物饮用水初探

张 薇, 唐 彬, 黎福荣, 赵 勇

(中山大学实验动物中心, 广州 510080)

根据GB14925-2010对饮水的要求，清洁级以上级别实验动物饮水应达到无菌要求。目前实验动物屏障设施制作饮用水的途径主要有： 超滤+臭氧发生器+紫外线灯、反渗透+臭氧发生器+紫外线灯和高温水等，但如何保障屏障设施中的输水网管、供水末端不滋生细菌，维持消毒杀菌的持续性是屏障设施饮用水的难点。

微电解技术，又称为内电极法技术。1980年代微电解技术引入我国，主要应用于染料、石油化工、重金属、医药等废水的处理。我单位于2008年首次将微电解无菌水机组应用到实验动物屏障设施饮用水系统的改造，取得了较好的消毒/灭菌效果。继而在2011～2014年先后将屏障设施的超滤+臭氧+浸没式紫外线消毒机组改造为超滤+微电解无菌水机组。为了探讨其对水、输水网管的持续消毒杀菌性能以及对实验动物健康是否造成影响，本研究对21日龄SD大鼠饮用微电解水与饮用高压灭菌水后1～8个月的SD大鼠血液生化进行跟踪检测，评估长期饮用微电解水是否对SD大鼠的血液生化造成影响。

1 材料与方法

1.1 微电解无菌水系统

由超滤+微电解机杀菌处理。微电解机为10 A、280 W，过滤材料主要有： 石英砂过滤器、5 μm保安滤器、0.1 μm超滤、1 μm精滤; 微电解设备由水处理设备公司提供。

1.2 主要试剂与仪器

Beckman CX-5全自动生化测定仪, 所用试剂、质控及标准均为美国Beckman公司产品; 乌来糖，购自国药集团化学试剂有限公司, 批号： 20150303。

1.3 动物与实验环境

21日龄清洁级SD大鼠购自中山大学实验动物中心[SCXK(粤)2016-0029]。

1.4 实验方法

1.4.1 无菌水的检测 检测方法依据GB/T1426.41-2001。设6个取水样的点： 屏障设施内用水末端设3个取水点1号、2号、3号; 微电解机房设2个取水点： 输水管网回水取样点4号、回水精滤后进入供水网管前为5号，高压灭菌后的自来水为6号; 在微电解开启1 h后，以无菌操作方法对上述取水点取样; 每样接种2皿营养琼脂，置35～37 ℃培育箱中48～72 h，观察皿营养琼脂皿中的菌落数，没有菌落生长，判断为无菌。

1.4.2 生化指标检测 21日龄SD大鼠160只，雌雄各半，母鼠在妊娠期及哺乳期均饮高压灭菌水,21日龄后分2组, 每组80只, 2组分别从21日龄开始饮用超滤+微电解水和高压灭菌水, 饲养1个月、3个月、5个月、8个月后各取雌雄20只大鼠，各组大鼠禁食12～14 h，用20%乌来糖溶液0.6 mL/100 mg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，用于测定生化指标共 17项： 血糖(GLU)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、总胆固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBiL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、磷(P)、钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、钙(Ca)。

1.5 统计方法

数据以SPSS22.0软件进行统计分析，结果用表示，对各项检测数据作单因素方差分析和T检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水的微生物检测

在2015年4月9日(2015ZD0166)的检测中没有设计4号、5号取样点，我们在跟踪观察中不断改进，2015年11月19日(2015ZD0610)增设4、5号取样点，结果5、6号取样点阳性。其余检测水样均未检测到细菌(表1)。

2.2 大鼠血液生化检测

21日龄SD大鼠饮用微电解无菌水与高压灭菌水1～8个月，生化检测结果比较，饮用微电解组与饮用高压灭菌水组差异无统计学意义(表2)。

3 讨论

在实验动物屏障环境的运行中，水的污染将直接导致屏障设施环境和动物的污染，最终影响实验动物质量和实验结果。超滤原理制作无菌水必须在超滤膜额定孔为0.001～0.02 μm时，才能拦截细菌和病毒。反渗透原理制作无菌水，由于反渗透(RO)膜的孔径达0.0001 μm，细菌、病毒大小是它的5 000倍，因此，只有水分子及部分矿物离子能够通过。但实验动物设施饮用水的末端，即饮水口或出水口，需要经过较长的输送管网方能达到。实验动物饮用水末端有两种形式： 自动饮水系统，饮水末端就是动物的饮水嘴; 另一种末端位于并暴露在设施内洁净区。SPF动物，所处设施环境也未能达到无菌，因此，无论是自动饮水嘴还是暴露于洁净区末端出水口，均可发生病原体逆行侵袭污染的情况。且无菌水从出水口到末端间较长的管网往往容易成为细菌滋生地。

屏障设施内动物饮水末端口的暴露和开放，动物饮水系统饮水管嘴与动物口腔食物的接触，极易造成逆行污染，若没有有效的持续杀菌机制，即使是无菌制水系统的初始端获得无菌水，也难以避免逆行污染。供水管网中的沉淀附着物以及循环供水管网的死角均有滋生微生物潜在风险。屏障设施无菌水系统的持续杀菌作用是杜绝逆行污染、供水管网沉淀颗粒和死角等污染的关键条件。

目前用于水消毒的方法很多，包括氯气消毒、臭氧消毒、紫外线消毒等。张德胜等[2]认为，氯气消毒会产生三卤甲烷等对人体、动物有害的物质。而臭氧消毒、紫外线消毒则存在成本高及没有持续杀菌效果等缺点，其实际应用有一定的局限性。赵鹏志[3]报道了微电解在人的直饮水管网消毒杀菌中具有良好的效果，认为臭氧能产生强氧化反应杀菌，但臭氧的强氧化反应, 能将聚丙烯(PP)滤芯及塑料管道、微量元素和矿物质氧化，破坏滤材和输水管网，并产生沉淀或胶体物质，影响水质或堵塞输水管网; 高浓度臭氧在空气中超过一定限值可能危及人的生命健康。紫外线消毒具有瞬间杀菌的效果，但没有持续杀菌作用，杀菌的强弱与紫外线灯的寿命和质量密切相关，随着使用时间的延长，紫外线逐渐衰减, 杀菌效果明显下降，需检测更换。加氯消毒虽然具有一定持续杀菌能力,但随时间的推移，氯离子与细菌等有机物的结合杀菌作用也会逐渐消减，而高浓度的漂白粉具有刺激性, 也存在消毒副产物的潜在威胁。李兵等[4-6]报道微电解对大肠杆菌有较好的杀菌作用，且与电流密度、时间具有正相关性。

表 1 2015年～2017年微电解无菌水微生物检测情况 菌落数/个

表 2 2组SD大鼠血液生化测定值

续表2

微电解灭菌的原理： 水分子在阴阳两级发生强的氧化还原反应产生活性物质， 破坏饮水中细菌的新陈代谢作用，降低其酶活性，使其不能在水中继续生存、繁殖，从而达到杀菌目的。微电解使水分子产生活化，活化的水分子对水中的某些有机物质产生重要作用，它改变和影响细菌的生理代谢，如基因表达式、酶活性等，最终导致细菌微生物失活直至死亡[7]; 二者协同作用于水中细菌物质最终达到灭菌目的。

本研究采用了10 A，280 W的微电解机组制作屏障繁育设施的无菌水，在2015年11月19日检测中，5、6号样品出现污染，5号是回水精滤后进入供水网管前水样，而回水取样点、末端采样点均未检测到细菌，说明1 μm精滤需立即更换;6号是高压灭菌水，其污染原因有可能是高压灭菌器功能下降、培养环节污染等; 无论何种原因，采取立即纠正可能存在的原因后，重新检测1～6号取样点的水样，结果没有出现污染。在对其长达二年多的跟踪检测中，微电解出水口、末终端出水口、回水检测点均未检测出细菌，表明应用微电解原理制作的无菌水达到了无菌要求，微电解对输水管网具有持续杀菌作用，能解决管道沉淀物和死角滋生微生物、终端供水口逆行污染等导致环境、动物污染的难题，可以保持屏障设施内用水的持续无菌; 微电解过程中，电极在水中放电, 伴随臭氧生成, 遍布在整个反应器及输水管网, 并持续存在,可能是微电解具有持续杀菌作用的原因之一[8]。

转氨酶、血脂类、蛋白类、血肌酐和血尿素氮、钾钠氯钙等分别与肝脏功能、肾功能、电解质平衡等密切相关，是动物重要的健康指标，也是动物应用于实验过程中常用的观察指标。通过对饮用微电解水、高压灭菌水后1～8个月SD大鼠的血液生化比较，显示2组差异没有统计学意义，表明微电解产生的活性物质等对离乳后饮用1～8个月的SD大鼠的血液生化没有影响; 在屏障设施中使用微电解制水可以保持输水管网、供水终端以及循环水的持续杀菌作用，微电解水可以作为SPF级实验动物的无菌饮用水。