毛竹笋醇提物对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的保护作用*

★ 徐彭 谢慧慧 谈伟锋 刘波*

(江西中医药大学药学院 南昌 330004)

毛竹属于乔本科刚竹属,四季常青,主要分布在我国长江以南,集中在长宁,江安等地,在江西也有大量分布,是我国主要竹类品种之一。毛竹笋则是在毛竹地上部分根茎上生长的嫩芽或鞭,是一种营养丰富的特色食材,研究发现毛竹笋富含多酚,生物碱,膳食纤维,氨基酸,总黄酮,多糖,植物甾醇等多种化学成分[1-4],但有关其药用价值的报道并不多。竹笋中所含的总黄酮和甾醇均具有抗氧化、抗菌等药理作用[6],且多糖和黄酮类化合物是防治急性肝损伤的主要成分[7-10]。本文主要采用南昌湾里梅岭生长的毛竹笋,通过腹腔注射D-氨基半乳糖复制小鼠急性肝损伤模型,探讨毛竹笋醇提物对急性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠,18～22g,雌雄各半,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2011-0003。小鼠进入实验室饲养1周后用于研究,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准,环境恒湿,室温20℃～23℃,实验期间自由饮水,实验前12 h禁食。

1.1.2 药材与试剂 毛竹笋是生长在江西省南昌市湾里区梅岭区域,清明时节采收,经江西中医药大学药学院刘勇教授鉴定为毛竹Phyllostachys edulis(Carr.)Lehaie 鲜笋。由江西省儿童医院药剂科采用乙醇提取,浓缩制备；D-氨基半乳糖购于sigma公司(批号：137238)；联苯双酯滴丸购于浙江医药股份有限公司新昌制药厂(批号：120523)；谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)试剂盒购于南京建成生物工程研究所(批号:20140705,20140709)。

1.1.3 实验仪器 倒置相差显微镜(德国Leica公司)；自动转轮切片机(德国Leica公司)；UV-2102C型紫外可见分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、模型复制及给药 60只小鼠随机分成6组,即正常组、模型组、联苯双酯阳性组、毛竹笋醇提物高、中、低剂量组,每组10只。模型组和正常组灌胃给予生理盐水,联苯双酯阳性组灌胃给予150mg/kg, 毛竹笋醇提物给药组依据高、中、低剂量分别灌胃给予生药量为28.13,14.06,7.03g/kg的毛竹笋醇提物,连续给药7天,在末次给药后,除正常组小鼠注射生理盐水外,其余各组小鼠均按500mg/kg剂量腹腔注射10%D-氨基半乳糖以复制急性肝损伤模型。造模后禁食不禁水,12h后眼眶取血,室温静置2h后,4℃,4000 r/min转速离心10min,收集血清,置于-20℃冰箱保存待检。

1.2.2 肝损伤指标酶含量测定 取血清,均按照试剂盒说明书进行测定血清AST、ALT的活性。

1.2.3 肝组织病理学检查 眼眶采血后,立即剪开小鼠腹腔,取相同部位肝组织,置10%甲醛溶液固定,并经过梯度乙醇脱水透明后进行石蜡包埋,常规切片,经苏木素-伊红染色,光学显微镜下观察各组小鼠肝脏病理学形态变化。

2 结果

2.1 毛竹笋醇提物降低D-氨基半乳糖致肝损伤小鼠血清AST、ALT的活性 与正常组相比,模型组小鼠血清中的ALT、AST均显著升高(P<0.01),说明肝细胞损害,急性肝损伤的模型复制成功。与模型组相比,阳性药物组和毛竹笋醇提物高、中、低剂量组各小鼠血清ALT均有显著降低(P<0.01)；阳性药物组和毛竹笋醇提物高、中、低剂量组小鼠血清中的AST也有降低,且呈剂量依赖性(见表1),说明毛竹笋醇提物具有保护肝细胞的作用,降低D-氨基半乳糖对肝脏的损害。

表1 毛竹笋醇提物对D-氨基半乳糖致肝损伤小鼠血清AST、ALT活性的影响(n=10)

注：与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01；与正常组相比,##P<0.01。

2.2 毛竹笋醇提物改善D-氨基半乳糖致肝损伤小鼠的肝组织病理变化 由图1显示,正常组小鼠肝小叶结构正常, 肝细胞结构完整,细胞分界清晰,肝索呈放射状有序排列。模型组小鼠肝组织正常结构消失,细胞索排列紊乱,肝细胞广泛脂肪变性,中央静脉周围的细胞大多出现空泡样变性。与模型组相比,阳性药组小鼠大部分肝脏肝细胞结构清晰,但小部分细胞还存在轻度肝细胞脂肪变性。相比模型组而言,不同浓度的毛竹笋醇提物均能使肝细胞的损伤减轻,毛竹笋醇提物高、低剂量组虽仍能看到少量肝细胞的脂肪性病变,但空泡样变性明显减少。

A：正常组；B：模型组；C：联苯双酯阳性组(150mg/kg)；D: 毛竹笋醇提物高剂量组 (28.13g/kg)；E：毛竹笋醇提物中剂量组(14.06g/kg)；F：毛竹笋醇提物低剂量组(7.03g/kg)。

图1 1小鼠肝脏的病理切片(HE×100)

4 结论

急性肝损伤主要由某些物质刺激引起,如饮酒过度,误食有毒物质,病毒感染等,导致肝细胞发生不同程度的肿胀、变性、坏死和凋亡的病理变化[11]。D-氨基半乳糖可引起与人类急性肝损伤相似的肝细胞形态和功能损伤,D-氨基半乳糖与细胞内磷酸尿苷结合形成复合物,干扰肝细胞内磷酸尿嘧啶核苷的形成,引起肝细胞损伤[12]。AST、ALT主要存在于肝细胞中,当肝脏受到刺激或是损伤时,肝细胞AST、ALT大量释放入血,使血清AST、ALT活性升高,因此,AST、ALT活性通常作为肝功能受损的重要监测指标,反映肝细胞有无损伤及损伤的严重程度[13-14]。

本研究结果显示,小鼠经腹腔注射D-氨基半乳糖后,血清AST、ALT活性均显著升高,且肝组织病理切片显示肝组织细胞不同程度的损害。毛竹笋作为常见的餐桌食品,味道鲜美,且具有一定的药用价值,前期研究发现对酒精致肝脏损害有一定的保护作用, 认为毛竹笋能增强急性肝损伤小鼠血清SOD活性和减少MDA含量,提高肝组织抗氧化能力[15]。而本研究发现毛竹笋醇提物也能显著降低D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤模型小鼠血清AST、ALT活性,进一步说明毛竹笋对肝细胞有保护作用。同时组织病理也显示,毛竹笋醇提物能明显减轻肝细胞肿胀、变性、坏死和凋亡等病理变化。但毛竹笋醇提物对肝组织的保护作用是否与抗氧化有关,还有待进一步探讨。