HPLC测定不同采收期女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量

2018-10-30杨元丰刘鑫谭舒舒杨武亮

江西中医药大学学报 2018年6期

★ 杨元丰刘鑫谭舒舒杨武亮

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室南昌 330004)

女贞子为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果实。其性味甘、苦、凉，归肝、肾经。具有滋补肝肾、明目乌发的功效[1]。《神农本草经》将其列之为上品，谓其“味苦平，主补中，安五脏，养精神，除百病”[2]。女贞子中主要含有萜类[3]、黄酮类[4]、苯乙醇类、多糖[5]等化学成分。近代药理研究表明女贞子具有抗炎、降血糖、保肝、抗衰老、抗癌及抗肿瘤等作用，并能提高免疫功能[6]。其中齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)和熊果酸(Ursohc acid，UA)是女贞子中主要脂溶性成分，两者属五环三萜类化合物，结构极为相似。

齐墩果酸毒性很低，具有多种生物活性：抗病毒、消炎、增强免疫和免疫调解、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、保肝、护肾、抗艾滋病毒等作用[7-9]熊果酸毒性小，具有多种生物学活性，尤其是在抗肿瘤、抗氧化、保肝、降血脂方面作用显著[10-12]。表明齐墩果酸和熊果酸是为女贞子的活性成分。2015年版《中国药典》规定女贞子在冬季果实成熟时采收，又因女贞分布地域广，各地果实成熟时间差异较大，其活性成分含量是否因女贞子采收期不同而受到影响。清代·汪昂的《医方集解》(刊于1682年)在对“二至丸”的制法记载中，对女贞子采集时间的要求“冬青子(即女贞子) 冬至日采……旱莲草夏至日采”[13]。是否女贞子应在冬至前后采收，未见文章报道。本文建立同时测定齐墩果酸和熊果酸含量的高效液相色谱方法，并对江西省南昌市湾里区江西中医药大学校园内不同采收时期的女贞子进行含量测定，研究两种萜类成分含量的动态变化，为指导当地女贞子的采收期及其应用提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪(自动进样器：G1329B;四元泵：G1311C；柱温箱：G1316A；DAD检测器：G4212B；Agilent色谱工作站)。万分之一天平(德国，Sartorius BT224s)；十万分之一天平(德国，Sartorius BT25s)；色谱柱：Dikma Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)。

齐墩果酸(批号：110709-201206)，熊果酸(批号：110742-201421)对照品均购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用。乙腈(HPLC级，美国Tedia公司)；其它试剂均为分析纯，水为双蒸水。

女贞子药材于冬至前后采于江西南昌湾里区江西中医药大学校园内(共12批，编号1～12)的同一棵女贞树，每隔1星期采集一次，采集时间见表7，并经江西中医药大学药用植物学科组赖学文副教授鉴定为木犀科植物女贞(LigustrumlucidumAit)的果实。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备分别取齐墩果酸、熊果酸对照品适量，精密称定，分别置25mL容量瓶中，加甲醇定容，得到每1mL分别含0.3536mg齐墩果酸与0.3440mg熊果酸的溶液，摇匀，即得齐墩果酸和熊果酸对照品各自的贮备液，备用。

2.2 供试品溶液的制备取女贞子干燥粉末(过三号筛)约1.0g，精密称定，加甲醇50mL，称重，水浴加热回流60min，放置室温，再称重，用甲醇补足减失的量，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件色谱柱 Dikma Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈∶甲醇∶水(1000mL含2mL磷酸和4mL三乙胺)=50∶33∶17；流速:1mL/min，进样量：10μL，检测波长：205nm；柱温：30℃。色谱图见图1。

A：混合对照品；B：样品；C：甲醇溶剂；1.齐墩果酸；2.熊果酸

2.4 线性范围考察分别精密吸取上述齐墩果酸对照品贮备液7.5mL、熊果酸对照品贮备液2.5mL，同置于10mL容量瓶中，得到分别含0.2652mg/mL的齐墩果酸和0.086mg/mL熊果酸的混合对照品溶液。采用自动进样方法，精密吸取2，4，6，8，10，12，14μL进样，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。齐墩果酸、熊果酸的回归方程分别为:Y=530.01X-16.28(r=0.9993)和Y=520.111X+2.4739(r=0.9990)，表明齐墩果酸、熊果酸分别在0.5304～3.7128μg 和0.1720～1.2040μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验精密吸取上述混合对照品溶液10μL，按上述色谱条件，重复进样6次，测得齐墩果酸、熊果酸峰面积RSD值分别为1.47%和1.77%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一供试品溶液(女贞子6号，含齐墩果酸1.88%，熊果酸0.18%)，分别于0，2，4，6，8，10，12h后进样，测得齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为0.42%和1.75%，结果表明供试品溶液在12h内稳定。

2.7 重复性试验精密称取同一样品6份(女贞子6号)，按供试品溶液制备方法分别制备6份供试品溶液，进样，测得齐墩果酸和熊果酸含量，计算其RSD，分别为0.20%和1.43%，结果表明方法的重复性好。

2.8 加样回收率试验精密称取已知含量的女贞子样品(女贞子6号)6份，每份0.5g，加入一定量齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，按2.2项制备方法制备，测定齐墩果酸和熊果酸的含量，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品含量测定取不同采收期干燥至恒重的女贞子(过三号筛)样品1.0g，按2.2项下方法制成供试品溶液，在2.3项色谱条件下，测量峰面积并用外标法计算样品中齐墩果酸与熊果酸的含量，样品含量测定结果见表2。

表2 不同采收期女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长确定齐墩果酸和熊果酸的全波长UV图发现其在紫外末端有吸收，本实验选取205nm为齐墩果酸和熊果酸检测波长。

3.2 流动相的优化本实验参考文献[14-15]，对齐墩果酸和熊果酸分离用流动相配比进行优化，最后以乙腈∶甲醇∶水(1000mL含2mL磷酸和4mL三乙胺)=50∶33∶17，两者分离度大于1。

3.3 检测池的选用本实验采用Agilent可变波长检测器(VWD)和二极管阵列检测器(DAD)，分别进样同浓度、同体积的齐墩果酸和熊果酸混合对照品溶液，测定其峰面积，比较测定结果。结果显示采用VWD检测器测得的峰高和峰面积较DAD检测器均低，其原因在于：VWD检测器的检测池体积有10μL，而DAD检测器的检测池的体积只有1μL，本实验采用后者检测器。

3.4 女贞子采收时期的确定表2中不同采收期女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量测定结果，表明江西南昌市湾里区在上述采收期内的女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量变化不大，并非在冬至前后会较高，故推断两成分与“女贞子在冬至前后采收”无关。

为此本文采用HPLC-FP[16]方法对上述不同采收期的女贞子中的红景天苷和特女贞苷含量进行了测定，以进一步判断上述两成分是否会受到女贞子采收时期影响。结果见图2。