大鼠主动脉内皮细胞改良型分离培养方法

林翠红，刘光辉，杨田野，赵 利，王 航，史常旋，孟 春

(1. 福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350108；2. 福建中医药大学附属人民医院，福建福州 350004)

血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)为血管管壁的内衬细胞，是血管重要的组成部分，具有复杂的代谢过程和生理功能。既往体内外研究表明，VECs在心血管疾病及肿瘤新生血管形成等病理生理活动中有重要作用[1-3]。目前，VECs体外研究中常用的原代细胞来自大鼠主动脉，但其分离、纯化、培养方法仍有待进一步优化。本研究在既往研究的基础上进行了改良、优化，建立了一种简单、高效的大鼠主动脉VECs分离、纯化及培养方法。

1 材料与方法

1.1实验动物健康雄性清洁级SD大鼠5只，体质量(45±5)g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[许可证号SCXK(沪)2007-0005]。实验动物的使用遵循国家科学技术委员会1988年颁布的《实验动物管理条例》。

1.2主要试剂与耗材及仪器ECM培养基(endothelial cell medium，ECM；美国ScienCell公司)，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS；美国Hyclone公司)，青链双抗(10 kU/mL青霉素+10 mg/mL链霉素；上海碧云天生物技术研究所)，胰蛋白酶(美国Santa Cruz公司)，Ⅰ型胶原酶、明胶(美国Sigma公司)，vWF兔多克隆抗体(von Willebrand factor vWF；美国Santa Cruz公司)，CD31兔多克隆抗体、第Ⅷ因子兔多克隆抗体(北京博奥森)，FITC标记的山羊抗兔荧光二抗(上海碧云天)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole DAPI；北京中杉金桥公司)。6孔板及培养皿(美国Corning公司)。眼科显微手术器械(苏州六六视觉科技股份有限公司)，倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)，CO2细胞培养箱(美国NUARE公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.3VECs的分离培养实验所用器具均经灭菌处理，所有操作均在无菌环境下进行。脱椎处死SD大鼠，将其置于含有750 mL/L乙醇的烧杯中浸泡消毒5 min。快速打开大鼠胸腹腔，分离出主动脉，置于含有PBS(含1%青链双抗，下同)的6 cm直径单孔培养皿中，转移至无菌操作台内。在眼科显微角膜剪、镊子及虹膜恢复器的辅助下，轻轻去除血管外周脂肪、结缔组织。漂洗3次去除外部杂质及血细胞，转移至装有PBS的备用单孔培养皿中。

将血管浸没于PBS中，用显微镊夹住血管远端内约3 mm处的管壁组织，保持远端管口自然张开。另一手持显微针持夹取尖的细缝衣针，将血管远端从管壁外侧顶入远端管口内。交替松开和夹持血管壁，将血管远端从远端管腔内逐渐递向近端管腔，自近端管口翻转出内膜，使得血管内膜暴露在外。漂洗3次去除残留的血细胞，吸弃多余PBS。

采用消化压片法处理翻转的血管组织，并设置单纯消化法组和单纯压片法组进行观察对比。消化压片法组：加入2 g/L Ⅰ型胶原酶2 mL，37 ℃下消化30 min后弃去，加入适量含血清培养基终止消化。将主动脉剪成20～25段1.0 mm左右长度的血管段，转移至用10 g/L明胶预先包被好的6孔板中央，每孔4～5段。用灭菌的盖玻片盖在血管段上方，轻轻下压，每孔加入2 mL含200 mL/L胎牛血清的ECM培养基进行培养。单纯消化法组：培养的血管段不进行盖玻片压片处理，余处理措施同消化压片法组。单纯压片法组：血管组织不进行胶原酶消化，余处理措施同消化压片法组。

将接种各组主动脉血管片段的6孔板置于50 mL/L CO2的细胞培养箱，37 ℃培养，72 h内禁止移动孔板。3 d后更换培养基，以后每2 d换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态，当原代细胞长满孔底80%左右时进行差异消化法传代。消化时弃去原培养基，PBS清洗1遍，加入2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃下消化2 min左右，显微镜下观察到VECs细胞收缩变圆、细胞间隙变大，而杂质细胞变化尚不明显时，吸弃胰蛋白酶，加入培养基终止消化，轻轻吹打孔板底部，促使VECs脱壁，并将消化细胞按照1∶3的比例接种进行传代培养，或者储存于―80 ℃保存备用。

1.4细胞鉴定形态学鉴定主要依据细胞的形态进行，在倒置相差显微镜下观察细胞形态、生长方式。取第3代近融合VECs，采用第Ⅷ因子、vWF和CD31等细胞标记物进行免疫荧光鉴定，激光共聚焦显微镜下拍照记录。

2 结 果

2.1VECs的生长特性消化压片法组和单纯消化法组的VECs在接种后48～72 h开始迁移出血管段，以血管段为中心贴壁生长。VECs前期迁移速度较慢，细胞呈梭形；后期迁移速度加快，细胞生长旺盛，呈长梭形或多角形。孵育6 d时，镜检见消化压片法组迁移出来的细胞数较单纯消化法组多，而单纯压片法组至第16天时才可观察到近似数目的细胞迁移生长(图1A、D、G)；经过连续观察发现，无论是前期VECs的迁移速度，还是后期细胞集落的形成速度，消化压片法组都明显快于单纯消化法组和单纯压片法组(图1)。

消化压片法组约6 d即可形成中等大的细胞集落，部分区域形成VECs典型的“网格状”或“管腔样”结构(图1A和图1B)。原代VECs 10～11 d可达到近融合状态(80%～90%融合)，此时细胞排列紧密，单层贴壁，呈现VECs典型的“铺路石”样特征(图1C)。以1×105/mL密度传代后的VECs在24 h内贴壁生长，5 d后细胞即可铺满整个孔板，形成单层的密集细胞群落。连续培养至第10代，细胞形态无明显变化。

图1不同实验组VECs生长情况的镜下观察

Fig.1 The growth of primary VECs in different groups

A～C：消化压片法组；D～F：单纯消化法组；G～I：单纯压片法组。A、D、G：VECs从组织块中迁移出来，绕其周边生长(消化压片法组和单纯消化法组孵育6 d，单纯压片法组孵育16 d)；B、E、H：迁移出的VECs形成典型的“管腔样”结构(消化压片法组和单纯消化法组孵育8 d，单纯压片法组孵育18 d)；C、F、I：近融合的细胞集落中VECs排列紧密，呈“铺路石”样特征(消化压片法组和单纯消化法组孵育11 d，单纯压片法组孵育21 d)。标尺=100 μm。

此外，取―80 ℃保存的细胞复苏培养，24 h后90%的细胞贴壁，换液洗去未贴壁细胞，显微镜下观察到贴壁细胞呈梭形或多边形，散在分布，胞质透亮，生长状态良好，培养3 d后增殖速度加快，需每天换液以保证充分的营养补给。

2.2VECs形态及免疫学鉴定分离获得的细胞单层生长，散在分布的单个细胞呈梭形、多角形或不规则形，生长到一定阶段后出现VECs特有的细胞集落形态，初期为相互交联的网格结构，后期形成中空的管腔样集落，进一步融合后呈现类似铺路石的密集细胞群落形态，有接触抑制。根据其形态特征、生长方式可初步判定为VECs。

取消化压片法组第3代VECs进行细胞鉴定，免疫荧光结果(图2)显示呈VECs形态的细胞其原代及子代细胞均阳性表达VECs细胞标记物第Ⅷ因子(图2 I)、vWF(图2 J)和CD31(图2 K)，阳性率高达99%。其他2组的鉴定结果相同(未附图)。本研究免疫鉴定至第8代，细胞标志物均呈阳性表达(未附图)。

图2VECs免疫荧光鉴定

Fig.2 Immunofluorescence of VECs

A～D：DAPI核染；E：第Ⅷ因子阳性表达；F：vWF阳性表达；G：CD31阳性表达；H：阴性对照；I～L：复合图。标尺=50 μm。

3 讨 论

VECs位于血管管壁内层，是组成血管的关键细胞成分，具有重要的生理功能，可充当机体天然屏障；参与免疫反应；调节内分泌；发挥凝血功能；控制血管渗透性；抵抗细胞黏附等[4-6]。此外，VECs还与炎症、心血管疾病、肿瘤转移等多种病理过程密切相关[1-2]。目前，VECs已成为医学、生物学领域日益关注的研究对象[7-8]。为促进VECs体外相关研究的开展，进一步明确其在各种生理病理活动中所起的作用，建立一套简单、高效的方法以获得高细胞量、高纯度的VECs至关重要。

既往已有各种VECs体外分离、纯化、培养及应用研究的报道。大鼠为实验室最常用的模型动物，现已成功地从大鼠的肺[9]、脑[10]、心脏[11]及视网膜[12]等组织血管中分离出VECs，而其中以主动脉VECs的分离培养最为常见[13-18]。1963年，MARUYAMA等[19]首次成功从人脐静脉分离出VECs，但未对其进行细胞鉴定。1973年，JAFFE等[20]改良了静脉VECs分离方法，并首先确立了相关的细胞鉴定指标。在此基础上，我国的张宝庚[21]于1985年首次成功培养了大鼠主动脉VECs。COLE等[22]也于1986年采用植块法获得了成功。但是，由于杂质细胞混杂等问题的存在，VECs的纯化一直较为困难。因此，ANDRE等[23]在1991年时提出酶消化并辅以机械刮除法进行纯化，该方法在提高VECs迁移速率的同时，能较好地排除杂质细胞的污染，但易造成细胞损伤。为了使VECs达到研究所需的细胞纯度并保持良好的细胞活力，1994年，NICOSIA等[24]将植环法用于大鼠主动脉VECs的分离培养并取得了成功。免疫磁珠法(MACS)在VECs分选实验中的最早运用见于1997年DONG等[25]的报道，而在2001年，KEVIL等[26]则采用酶消化法结合流式细胞术(FACS)对主动脉VECs进行免疫鉴定和纯化。这类方法较好地提高了VECs的细胞纯度，但受MACS分选成本高昂、FACS操作复杂等因素限制，其推广应用受到了一定的阻碍。为此，2004年，林泽绚等[27]在植环法的基础上采用瞬间热处理以抑制外膜杂质细胞活性，从而提高VECs纯度。2008年，外翻结扎法因其仅使血管内壁暴露在外从而较好地隔离了杂质细胞而被肖琼等[28]采用。2012年，季政等[18]则将血管外剖法与酶消化法结合进一步改良了大鼠主动脉VECs的分离、纯化方法。本研究作者之前也重复了这些改良方法，发现其确实可以给实验带来了一定的便利，但是培养出的细胞增殖能力有限，分离、纯化等操作过程仍有待优化、改进。

目前，已报道的大鼠主动脉VECs多取材自成年大鼠，而成年大鼠的细胞增殖能力较幼鼠的增殖能力弱[29]。本研究选用45 g左右的SD大鼠为实验材料。该阶段大鼠为3周龄左右，具有独立的存活能力，易于获得。更重要的是，其胸腹主动脉较鼠龄更小的大鼠发育更成熟，便于剖离、翻转，组织具有优越的细胞成熟性和细胞活性，能充分满足分离培养的要求，可获得数量多、增殖快的原代细胞[30]。

本研究的关键之一在于如何简便获取有效的、高活性的主动脉血管片段用于培养。既往研究在处理主动脉时或选用植块法或植环法将组织块接种于培养瓶中，或借助镊子及针线使血管外翻并结扎两端仅暴露出血管内壁，或纵向剖开血管使内壁直接贴附于孔板底部，结合酶消化法加快细胞迁移等办法[16,18,28]。本研究对既往文献报道的方法[16,28]进行了改进，采用了血管外翻植环法+酶消化法+压片联合法来实现这一目标。在分离主动脉血管后，采用细缝衣针简化外翻操作，最大限度地减小了血管内壁损伤，并在消化后利用显微剪将组织分成动脉环，转移至6孔板培养，同时进行压片处理。

本研究发现，血管外翻植环法+酶消化法+压片联合法的操作使得VECs的迁移速度加快，细胞活性高。剖离出整条血管后外翻，使血管内壁完全暴露，胶原酶均匀覆盖在内壁血管四周进行短时间的充分消化，产生了具有良好活性的血管片段。研究中观察到，消化组细胞的迁移速度明显高于未消化组，且经过多组多次重复实验，消化时间可准确控制，重复性好。同时，压片法使得组织块与孔板的接触更为紧密，有助于提高前期细胞的迁移速度，消化压片法组在第6天时即可观察到明显的网格状细胞结构，而单纯消化法组则在第8天时才可观察到类似集落。此外，该联合法获取的细胞量大，增殖快。研究中经酶消化、分剪后的血管片段可以铺放多孔，而且血管片段可以重复利用。同时根据细胞迁移情况，铺孔的血管片段在第1次孵育4～5 d后即可转移至新孔再次培养。本研究观察到血管片段持续转移3次培养后仍有VECs迁移出，且可快速增殖形成集落。不仅如此，压片后的组织块迁移出的细胞还可同时在孔板底部和玻片上生长，细胞量翻倍，单次分离实验可获得的细胞数量多。

如何获取高纯度的VECs则是本研究的另一个关键点。本方法在血管外翻消化培养的基础上，配合ECM培养基筛选和差异消化法控制，明显提高了VECs的纯度。主动脉管壁内膜主要由单层的VECs和很薄的一层结缔组织构成，快速、简单操作避免内膜的机械损伤，结合低浓度、短时间的胶原酶内壁单面消化，既避免了中膜损伤导致平滑肌细胞的迁移[31-32]，又排除了血管外壁其他组织碎屑的影响，阻碍了大部分外壁杂质细胞的迁移。同时，ECM培养基营造的低糖且含内皮细胞生长补充因子(ECGS)的环境，使VECs得以在最适宜的环境条件中成为主体细胞，迁移速度快、数量多。更在传代时辅以差异消化法控制，将传代后的VECs转移至新的孔板中，能够较有效地清除平滑肌细胞、成纤维细胞等杂质细胞并抑制其生长。

通过上述方法培养获得VECs后，进一步在形态学观察的基础上结合免疫荧光法对所培养的细胞进行了鉴定。培养过程中，观察到细胞形态为梭形或多角形，存在接触抑制现象，生长到一定密度后会呈现典型的“网格状”或“管腔样”结构，这与既往研究报道的VECs的细胞形态特征、生长特性相符，初步表明该方法分离到的细胞是VECs。为进一步确定其细胞类型，本研究选择第Ⅷ因子、vWF和CD31共3种VECs细胞标记物进行免疫鉴定。第Ⅷ因子作为最早运用于鉴别内皮细胞的蛋白因子，从20世纪70年代起已被广泛运用[33]。而vWF，即第Ⅷ因子相关抗原，在动物体内仅有内皮细胞、血细胞及巨核细胞能够表达该蛋白，主要分布于细胞质中，是VECs与血管平滑肌细胞、成纤维细胞相区别的特异性抗原，常作为鉴别VECs的特征之一[33-34]。另外，CD31蛋白，又称血小板/内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)存在于内皮细胞间紧密连接处，参与血管生成，与VECs在心血管疾病中发挥调节功能有关[35]，是VECs重要的细胞标记物。此3种标记物常见于国内外关于VECs鉴定的各类文献中，具有可比性。同时，由于大鼠胸腹主动脉的细胞成分较为简单，此3种标记物用于鼠胸腹主动脉VECs鉴定具有相对的特异性。本研究荧光共聚焦结果显示，分离到的细胞皆呈第Ⅷ因子、vWF和CD31阳性表达，且阳性率接近99%，充分证明该改良方法获得的细胞确为高纯度的VECs。

综上所述，本研究成功建立了一种简单、经济的大鼠主动脉VECs分离、纯化、培养方法，将为体外研究VECs的病理生理机制及其在相关疾病中的作用提供了极大的方便。