纤维介素2在慢性病毒性肝炎患者中的表达水平及临床意义

陈云茹，孙阳阳，邸 莹，唐甜甜，杨雪亮，张 曦，刘小静，叶 峰，蔺淑梅

(1. 西安交通大学第一附属医院感染科，陕西西安 710061；2. 中国解放军第一医院药剂科，甘肃兰州 730000；3. 西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061；4. 西安市儿童医院感染科，陕西西安 710003)

纤维介素2(fibrinogen-like protein 2, Fgl2)，也称为Fgl2凝血酶原酶，属于纤维蛋白原相关蛋白超家族，是一种多功能蛋白，有两种类型：跨膜型Fgl2和可溶性Fgl2(soluble Fgl2, sFgl2)。跨膜型Fgl2作为一种新的凝血因子，其表达异常能够引起凝血功能紊乱，激活凝血过程，导致纤维蛋白沉积[1]。sFgl2主要是由T淋巴细胞分泌，作为一种免疫抑制因子，它具有抑制T淋巴细胞和树突状细胞的功能，介导B淋巴细胞的凋亡[2]。国内外已有研究表明，Fgl2与同种及异种移植排斥反应、自发性流产、病毒性肝炎、严重急性呼吸道综合症及肿瘤等疾病有关[3-7]。近年来，Fgl2在病毒性肝炎发病机制中的作用越来越受到重视。我国学者研究发现，Fgl2的表达与乙型肝炎患者病情的严重程度密切相关，减少和阻断其表达有可能成为重型肝炎新的治疗途径和方法[8-9]，但研究主要以病理组织为基础。多伦多大学学者[10]研究了丙型肝炎患者外周血中sFgl2的表达，结果提示Fgl2可能参与HCV感染后的疾病进展，但未对其临床价值进行深入探讨。为进一步了解sFgl2与慢性病毒性肝炎患者肝脏功能及肝硬化的关系，探讨其对预测患者临床转归和预后的价值，本研究检测了慢性肝炎患者外周血中sFgl2水平，并与临床相关指标进行对比分析。

1 材料与方法

1.1研究对象收集2009年9月至2014年3月西安交通大学第一附属医院感染科门诊和住院部首次诊断为慢性乙型肝炎患者42例，乙型肝炎肝硬化患者35例，慢性丙型肝炎患者43例，丙型肝炎肝硬化患者73例。我院体检中心72例健康体检者为健康对照组。

患者共193例，男性136例，女性57例，平均年龄(45.79±13.82)岁。健康对照组72例，其中男性46例，女性26例，平均年龄(47.9±11.80)岁。患者组及健康对照组在年龄及性别间无差异。所有病例诊断均符合2015年中华医学会感染病学分会及肝病学分会制定的《中国慢乙肝防治指南》及《中国丙肝防治指南》，即HBsAg及HBV DNA阳性或HCV抗体及HCV RNA阳性半年以上，并结合症状、体征及实验室影像学检查。入选的患者均未接受抗病毒治疗。排除甲、丁、戊型病毒性肝炎、乙肝及丙肝重叠感染、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝癌、自身免疫性肝炎及其他自身免疫性疾病以及存在严重心脏、肾脏疾病的患者。本研究经西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准，并取得受试对象的知情同意。

1.2标本的采集与处理收集193例患者及72例健康体检者的空腹静脉血5 mL，在抽血后30 min内置于离心机3 000 r/min，离心10 min，分离出血清，分装至1.5 mL离心管中，放置于-80 ℃冰箱保存。

1.3研究方法应用酶联免疫吸附法(ELISA)，按照试剂盒[人纤维介素蛋白酶联免疫分析试剂盒(ELISA)美国R&D公司]说明书检测患者外周血sFgl2水平；应用全自动生物化学分析仪检测患者外周血ALT、AST、TBIL、ALB等。应用定量聚合酶反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)方法检测患者血清HBV DNA及HCV RNA载量。

1.4统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料用中位数表示，对各组年龄、性别比较分别采用方差分析和卡方检验。不同组患者及健康对照组外周血sFgl2水平比较采用秩和检验，外周血sFgl2水平与病毒载量的相关性分析应用秩和检验。血清sFgl2水平与ALT、AST、ALB及TBIL等进行Spearman相关性分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1不同组别血清sFgl2水平如图1所示，健康对照组、慢性乙型肝炎组、慢性丙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组、丙型肝炎肝硬化组sFgl2水平分别为9.75、32.14、10.89、67.60、35.27 ng/mL；乙肝肝硬化患者sFgl2水平高于慢性乙肝患者(P<0.001)，丙肝肝硬化患者sFgl2 水平高于慢性丙肝患者(P=0.023)；乙型肝炎肝硬化患者sFgl2水平高于丙型肝炎肝硬化患者(P=0.024)，且各组患者sFgl2水平均高于健康对照组。

图1不同组别血清sFgl2水平

Fig.1 The level of serum sFgl 2 in different groups

2.2不同程度肝硬化患者外周血sFgl2水平不考虑病原学，根据肝硬化的Child-Pugh分级标准将肝硬化患者进行分级，其中，Child A级48例，Child B级34例，Child C级26例，由图2可知，Child评分越高，血清sFgl2水平越高，3组之间具有统计学差异(P=0.011)。Child C级患者sFgl2 水平明显高于Child A级(P=0.004)和Child B级(P=0.042)；Child B级患者sFgl2水平高于Child A级，但两组之间差异无统计学意义(P=0.188)。

图2各组sFgl2水平与Child-Pugh分级的关系

Fig.2 Correlation between sFgl 2 and Child -Pugh grades

2.3血清sFgl2水平与乙型肝炎患者病毒复制水平的相关性分析对慢性HBV感染者进行HBV DNA载量检测，将HBV DNA水平分为≤103IU/mL、103107IU/mL 4组，用秩和检验分析sFgl2在HBV DNA 4组间的分布情况，差异无统计学意义(P=0.247，图3)。

2.4血清sFgl2水平与丙型肝炎患者病毒复制水平的相关性分析将慢性HCV感染者根据HCV RNA载量分为≤103IU/mL、103106IU/mL 5组，用秩和检验分析sFgl2在HCV RNA 5组间的分布情况，差异无统计学意义(P=0.713，图4)。

图3不同HBVDNA载量组血清sFgl2水平

Fig.3 The level of serum sFgl 2 in different groups of HBV DNA load

图4不同HCVRNA载量组血清sFgl2水平

Fig.4 The level of serum sFgl 2 in different groups of HCV RNA load

2.5血清sFgl2水平与患者ALT、AST、TBIL、ALB的相关性分析血清sFgl2与ALT、AST、TBIL和ALB分别进行相关性分析，sFgl2与ALT及AST均无相关性(r=-0.044，P=0.652；r=0.065，P=0.507，图5A、5B)，sFgl2与TBIL正相关(r=0.226，P=0.019，图5C)，sFgl2与ALB负相关(r=-0.209，P=0.03，图5D)。

图5血清sFgl2水平与患者肝功指标的相关性分析

Fig.5 Correlation between of serum sFgl 2 and liver function indexes in the patients

3 讨 论

Fgl2是近年来发现的一种多功能蛋白，含有439个氨基酸，分为跨膜型及可溶性两种[1]。可溶性纤维介素2是一种新发现的由调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)分泌的重要的效应分子，其生物学功能已成为近年来研究的热点[11]。有研究表明，Fgl2可导致敏感型小鼠爆发性病毒性肝炎[3]，CHAN等[12]报道了小鼠的sFgl2能抑制T淋巴细胞的增殖，提示sFgl2在免疫耐受方面发挥了重要的作用。进一步研究发现，sFgl2可通过与B细胞表达的FcγRⅡB连接而诱导B细胞凋亡[13]。重组的sFgl2还可以通过增加IL-4和IL-10水平促进T细胞形成Th2细胞，抑制IL-2、IFN-γ 等Th1细胞因子分泌，发挥免疫调节作用[14]。综上推测，Treg细胞分泌的sFgl2可能抑制了机体针对于肝炎病毒的T淋巴细胞反应，从而促进了病毒的复制和肝病的进一步发展。因此，sFgl2在病毒性肝炎发生发展中的作用值得深入探讨。

本研究比较了不同人群外周血sFgl2水平，发现血清sFgl2水平在肝硬化组显著高于非肝硬化组及健康对照组。乙型和丙型肝炎病毒慢性化感染及慢性化感染导致的肝硬化的机制十分复杂，大量研究表明，Th1/Th2细胞失衡及免疫耐受状态对HBV及HCV感染导致的慢性化起到了重要作用[15-16]，本结果提示，升高的sFgl2可能是导致免疫耐受状态的重要环节。因此，针对sFgl2的治疗可能成为慢性病毒性肝炎潜在的免疫治疗靶点。

Child-Pugh分级是目前临床常用的评估肝硬化严重程度的量化指标，该评分虽简便易行，但其中有两项(肝性脑病、腹水)是主观指标，根据医生临床经验的不同可能产生误差，且药物的使用(如使用利尿剂或乳果糖、输白蛋白)可能会影响上述两种指标的评估，需要进一步探索能够更准确预测肝硬化患者预后的客观指标[17]。本研究结果显示，不管肝硬化的病因学为HBV或HCV，随Child-Pugh评分升高，外周血sFgl2水平有逐渐升高的趋势，Child C级患者sFgl2水平明显高于Child A级和Child B级，差异有统计学意义，提示sFgl2与肝硬化的严重程度相关，可能成为预测肝硬化预后的重要指标。

此外，本研究还比较了外周血sFgl2与乙肝及丙肝患者病毒载量的相关性，研究结果显示，无论是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒，sFgl2均与病毒载量无相关性，而加拿大的NAZIA SELZNER等[10]对80例HCV RNA阳性的患者检测了外周血的sFgl2，发现sFgl2与HCV RNA水平呈正相关，两个研究结果的不一致可能与研究的纳入标准不同有关，需大样本研究及体外实验进一步验证。

同时，我们还分析了sFgl2水平与肝功能的相关性，结果显示，无论是乙型肝炎或丙型肝炎患者，其 sFgl2水平与TBIL呈正相关，与ALB呈负相关，提示sFgl2可能参与了肝细胞的炎症坏死，从而影响了肝细胞的合成功能。

有趣的是，本研究还发现，乙型肝炎肝硬化患者sFgl2水平明显高于丙型肝炎肝硬化患者，差异有统计学意义，已有研究表明，HBV C蛋白和X蛋白及丙型肝炎病毒的核心蛋白均具有激活人Fgl2基因的功能[18-19]，需进一步探讨两种病毒对Fgl2基因的激活功能的差异及相关机制。

本研究具有以下局限性。由于重点在于分析sFgl2与慢性病毒性肝炎肝损害临床指标的相关性，故未涉及机制研究；本研究为病例对照研究，其结论需队列研究进一步论证。

总之，作为一种多功能蛋白，sFgl2参与肝硬化、肝癌及重型肝炎的病理生理过程，具体机制涉及凝血及免疫功能的调节。本课题组进一步证实了外周血sFgl2在肝硬化患者中明显升高，同时发现sFgl2水平与肝硬化患者Child分级有相关性，可能作为肝硬化患者的预后因素之一，需要建立长期随访队列，进一步评估外周血sFgl2水平与肝硬化、肝癌进展及预后的相关性，为肝硬化患者预后的评估提供有效工具。