5种血清微小核糖核酸在主动脉夹层患者中的表达变化及联合诊断价值研究

芦 洁 陈垚志 李玉琳 刘卓慧 马 珂 王绿娅 杜 杰

表1 cDNA合成反转录特异引物序列

注：RT primer：反转录引物

主动脉夹层(aortic dissection，AD)是由于主动脉壁内膜和中层撕裂，形成内膜撕裂口，使中层直接暴露于血管腔，主动脉腔内血液在动脉压的驱动下，经撕裂口直接穿透病变的中层，使中层分离而形成，是一种极为严重的大动脉疾病。其发病急、进展快、病死率高，若未及时救治，急性AD发生后48 h 内，病死率高达50% ～68%，3个月内病死率可达90%[1-2]。目前，AD的诊断主要依靠临床表现和影像学技术，但是临床表现缺乏特异性，而影像学诊断往往不够迅速，临床现有生物标志物中D-dimer应用较普遍，敏感度很高但特异度较差[3]，AD初期误诊率高达25%～50%[4]。据文献报道循环微小核糖核酸(microRNA)有作为心血管疾病生物标志的潜能。因此，目前临床急需一种生物标志物可以提高AD诊断的灵敏度和特异性。根据过以往文献报道筛选出5个生物学功能可能与AD病理机制相关且在血清中表达量较高microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)，本研究旨在探讨这5个血清microRNA作为新型生物标志物在AD诊断中的价值。

资料与方法

1.一般资料 选择2015年9月至2016年3月期间在北京安贞医院就诊并最终确诊为AD患者60例为AD组，其中男性45例，女性15例，平均年龄(51.95±11.47)岁。同时选取年龄性别匹配的在北京安贞医院体检显示健康者60 例为对照组(HC组), 其中男44例，女16例，平均年龄为(52.28±9.88) 岁。AD诊断标准：基于超声心动图或主动脉CT血管成像检查或者手术发现确诊[5]。AD排除标准：AD患者伴随有先天性心血管疾病、妊娠、系统性炎症疾病、肝功能异常、肾功能异常、马方综合征、心力衰竭、肿瘤、冠心病者；创伤性或医源性夹层；未接受影像学检查(CT或TEE)；无入院D-dimmer检测结果；无可用血清样本。本研究经北京安贞医院伦理委员会批准，所有入组人员均签署知情同意书。

2. 微小核糖核酸检测 (1)血清收集与处理 抽取AD患者入院24h内外周全血3mL，对照组常规采血，经2 000g离心15min后取上清液于无RNA酶(RNase-free)EP管，分装后置于-80℃低温冰箱保存。所有样本统一按照mirVana miRNA isolation 试剂盒说明书提取血清miRNA，为了防止RNA降解，在提取RNA前加入RNAlater。

(2)微小核糖核酸反转录为cDNA 采用Life公司的反转录试剂盒进行RNA反转录反应。反转录反应体系的配置为：2μL dNTP(2.5mM each)，2μL 10XRT Buffer，0.3μL RT特异引物(1μM)(表1)，200ng Total RNA，0.2μL MMLV反转录酶(200U/μL)，0.3μL RNA酶抑制剂(40μ/μL)，20μL无RNA酶水。配置好体系后在PCR扩增仪进行逆转录反应，条件为16℃ 30min，42℃ 40min，85℃ 5min。反应结束后，将其放在冰上待用。

(3)荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)扩增cDNA 采用Life公司的qRT-PCR试剂盒进行qRT-PCR反应，采用Taqman HT7900荧光定量PCR仪进行PCR扩增，反应条件为95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10s；60℃，60s)。反应体系为8μL反应体系(5 μL 2×Master Mix，0.5μL 10μmol/L的PCR特异引物F，0.5μL 10μM 的PCR特异引物R)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/s)。

(4)血清microRNA表达量计算 各样品中5个目的miRNA和内参U6分别进行qRT-PCR反应。采用2- △△ CT法计算5个microRNA在血清中的相对表达量。

3. 统计学方法 采用SPSS 23 软件进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验分析计量资料正态性，计量资料符合正态分布采用均数±标准差表示,两组间比较采用两独立样本均数的t检验，非正态分布资料采用中位数(M)及四分位数间距(P25，P75)表示。两组间比较采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验。计数资料以例数(百分数)表示,两组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。5个microRNA血清相对表达量在两组间的比较通过对数据进行log10转换后以散点图展现。通过绘制受试者工作(ROC)曲线评价5个microRNA单独或联合对于AD的早期诊断价值，用逻辑回归模型拟合多个microRNA的联合诊断，根据约登指数确定截断值，以曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、阳性预测值和阴性预测值等指标评价microRNA的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.两组间基线资料比较 HC组与AD组在年龄、性别、吸烟史、高血压史、糖尿病史、血脂水平、血糖水平和肾功能指标比较均差异无统计学意义(P>0.05)。AD组体质量指数(BMI)、D-二聚体(D-dimer)、C反应蛋白(C-reaction)水平高于HC组(P<0.05, 表2)。其中BMI并未报道过与AD有关，D-dimer和CRP都是已知在AD中上升的因子，与既往报道一致，且与本文研究的5种microRNA无相关性。

表2 两组间基线资料比较

2.两组间5个血清microRNA表达水平比较 通过qRT-PCR方法检测HC组和AD组中5个血清microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)的相对表达水平变化，两组间比较结果显示，与HC组相比，5个血清microRNA相对表达水平在AD组均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05, 图1)。

3.ROC曲线分析单个血清microRNA区分两组的诊断效能 ROC曲线区分AD组和HC组，5个血清microRNA的曲线下面积(AUC)均>0.7(P均<0.05)，其中has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p的AUC>0.9，分别为0.915(95%CI:0.862～0.968)、0.912(95%CI:0.862～0.962)和0.910(95%CI:0.860～0.960)，另外has-miR-21-5p和has-miR-223-3p的AUC分别为0.732(95%CI:0.642～0.822)和0.717(95%CI:0.618～0.815)，结果显示5个血清microRNA均对AD组和HC组有较好的区分能力。为了发掘临床潜在应用价值，根据约登指数确定各microRNA 的截断值，同时分析灵敏度和特异度，这些指标显示5个microRNA均有较好的临床诊断价值(图2，表3)。

图1 两组间5个血清microRNA表达水平比较

图2 单个血清5种microRNA区分两组的ROC曲线 注：AUC：曲线下面积

4.ROC曲线分析联合多个血清microRNA区分两组的诊断效能 根据单个microRNA的ROC曲线分析，选出AUC>0.9的3个microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p)联合为Signaturea，5个microRNA全部联合为Signatureb，通过ROC曲线分析多个microRNA联合对于区分AD组和HC组的诊断效能。Signaturea将AUC提升至0.958(95%CI:0.924～0.992，P<0.05)，诊断灵敏度和特异度均较高。Signatureb将AUC提升至0.964(95%CI:0.935～0.993，P<0.05)，诊断灵敏度高达96.67%，诊断特异度也较高。各指标分析结果显示Signaturea和Signatureb相比于单个microRNA的诊断效能有较大提升(图3，表3)。

图3 联合多个microRNA区分两组的ROC曲线 注：Signaturea：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p；Signatureb： has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR- 143-3p +has-miR-21-5p + has-miR-223-3p；AUC：曲线下面积

microRNAAUC95%CIP值△AUCP值截断值灵敏度/%95%CI特异度/%95%CIas-miR-26a-5p0.9150.862～0.968<0.00010.0430.04144<0.4378.3365.8～87.995.0086.1～99.0has-miR-191-5p0.9120.862～0.962<0.00010.0460.02289<1.6991.6781.6～97.275.0062.1～85.3has-miR-143-3p0.9100.860～0.960<0.00010.0480.00766<0.2383.3371.5～91.788.3377.4～95.2has-miR-21-5p0.7320.642～0.822<0.0001<0.5368.3355.0～79.771.6758.6～82.5has-miR-223-3p0.7170.618～0.815<0.0001<0.578.3365.8～87.971.6758.6～82.5Signaturea0.9580.924～0.992<0.0001<0.6286.6775.4～94.193.3383.8～98.2Signatureb0.9640.935～0.993<0.0001<0.3096.6788.5～99.683.3371.5～91.7

注：Signaturea：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p；Signatureb：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p + has-miR-21-5p + has-miR-223-3p；△AUC及其P值是基于has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p分别与Signaturea比较的结果

讨 论

AD发病急、病情进展快、病死率高、预后差, AD患者及时诊断和及时治疗可以提升一年生存率超过50%[6]，因此AD患者早期诊断至关重要。诊断AD的传统方法主要有经食道超声(transesophageal echocardiography, TEE)、主动脉CTA、MRI 及血管造影，但检查耗时长、价格昂贵且需搬运患者。如果患者体内存在金属植入物，传统的方法也不能进行诊断[3]。既往研究发现一些可用于AD诊断的候选生物标志物，如D-二聚体水平对AD诊断具有极高的灵敏度，但特异性较低(46.6%～68.6%)，误诊率高；平滑肌肌球蛋白重链(smMHC)和可溶性弹性蛋白片段(sELAF)灵敏度和特异性较高，但在临床紧急情况下不可行，通过目前已有的生物标志物想要实现AD快速准确诊断较难。因此，临床上急需找到具有高灵敏度和高特异度的生物标志物以快速准确地诊断AD。

近年来研究表明，血清microRNA在心血管发育和疾病发生发展过程中起重要作用。microRNA是一类非编码微小分子RNA，长约20bp，功能主要为调节基因的表达，参与细胞生长、增殖、分化等生命过程，在不同生理或病理状态下呈现差异性表达，并具有组织器官特异性[7]，有作为某些疾病诊断或预测标志物的潜能。例如，Matsumoto等[8]发现血清miR-192，miR-194和miR-34a的水平能够预测AMI后缺血性HF发生, Anke 等[9]也发现MiR423-5p 可作为HF诊断的生物标志物。

AD 发病最重要的病理及生理机制为主动脉中层的弹力纤维、胶原蛋白变性，随着内膜破裂形成血肿，可撕开变性坏死的中层，导致夹层的形成并破裂。血流动力学改变使主动脉壁弹力纤维和胶原纤维变形，血管壁弹性下降，血管内膜易被撕裂而形成动脉夹层，严重时可导致破裂出血。据先前的研究报道， miR-26a-5p可以抑制血管平滑肌细胞的分化和凋亡，促进增殖和迁移，促进平滑肌由合成表型向收缩表型转换增多[10]，miRNA-143-3p可调节平滑肌的表型转化和血管内环境稳定性[11]，所以miR-26a-5p和miRNA-143-3p表达降低可能促进AD的形成；miR191-5p通过激活NF-κB信号通路有效地抑制血管生成[12]，miR-223-3p通过影响RPS6KB1 / HIF-1α信号通路来抑制血管生成[13]，所以miR-191-5p和miR-223-3p表达下降可能抑制夹层破裂后血管的修复过程；miRNA-21-5p调节心脏成纤维细胞中的ERK-MAP激酶信号传导途径，对血管结构和功能的调整有重要作用，所以miRNA-21-5p表达下降可能影响血管结构纤维化而导致夹层发生[14]。基于这些microRNA已知的生物学功能，我们猜测它们可能与AD的发生发展有一定关联，但是具体这5个microRNA可能参与了AD发生发展的哪一环节有待探究，不能确定AD的是因还是果。所以我们探讨了这5种microRNA在AD血清中的表达。本研究中，我们发现5种microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)在AD患者血清中表达水平显著降低(P<0.05)。ROC曲线分析显示5个microRNA诊断AD的AUC均在0.7以上，其中has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p诊断AD的AUC可达0.9以上，且灵敏度和特异度均较高。将多个microRNA联合进行ROC曲线分析，AUC>0.9的3个microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p)联合和全部5个microRNA联合可分别将AUC提升至0.958和0.964，且灵敏度和特异性也得到较大的提升，说明将多个microRNA联合诊断AD效果更好。我们的研究结果表明，血清microRNA有极大的潜能可以作为生物标志物应用于AD的早期快速诊断。但是，本次研究也存在以下局限性：①本次研究样本数量较少，仍需要进一步扩大样本验证以及更深入的分析来进一步验证血清microRNA在AD诊断上的潜在价值；②血清microRNA检测的费用较高，检测方法需要较先进的技术，实际应用有一定难度，距离运用于临床诊断仍有较长的路要走。③本研究并未比较AD与其他有相似症状的急诊患者比如肺栓塞或急性心肌梗死患者中5种microRNA的表达差异，有待后续探究。

总之，我们的研究结果表明血清microRNA有作为AD早期快速诊断生物标志物的应用潜能，也为进一步探索血清microRNA对于AD的早期诊断价值提供了数据理论支持。