血清浓度对MDCK细胞低密度培养的影响研究

王 娟，乔自林,2，冯玉萍

(1.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030)

新生牛血清(Nnewborn Calf Serum，NBCS)为细胞增殖和维持生长提供所需的营养成分和生物因子，是动物细胞培养的重要原辅材料[1].体外培养的动物细胞需要添加一定量的NBCS才能维持其生长.不同细胞系对NBCS的需求量可能不同，量加多了造成浪费，量加少或不足会影响生长.VERO细胞通常培养时添加10%NBCS(v/v).在IPV疫苗的生产中发现5%NBCS就满足生产需要，节约了生产成本.由于NBCS来源有限且价格很高，确定其在细胞培养阶段最经济有效的添加量是生物制品大规模生产工艺研究的重要内容.MDCK细胞系(Madin-Darby canine kidney cell line，MDCK)是从犬肾组织中分离培养获得的上皮样贴壁细胞，该细胞可用于多种病毒的繁殖和纯化.近年来，大量围绕MDCK细胞系替代鸡胚用于流感及禽流感病毒的监测、研究及疫苗生产的研究有了突破，为细胞基质的新型流感疫苗的开发提供了理论支持，MDCK细胞的流感疫苗是大势所趋[2-5].细胞的贴壁率是分析细胞增殖和存活的重要指标之一，在动物细胞培养技术中广泛应用.任何细胞被置于体外时，对细胞培养环境有一个适应过程，其间细胞对培养液具有同化作用，而单细胞的同化能力不如群体细胞强.细胞低密度接种培养相当于给细胞人为地降低了群体效应或同化能力，实验结果更加真实地反映出细胞对培养液的适应情况.文章研究了不同浓度NBCS对低密度培养MDCK细胞的集落数和贴壁率，为该细胞的大规模培养提供参考.

1 材料与方法

1.1 MDCK细胞

P70，(由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供)；新生牛血清(NBS，兰州民海生物工程有限公司，批号：20161024)；0.25%胰蛋白酶(兰州百灵生物技术有限公司，批号：20170115)；DMEM培养基(兰州百灵生物技术有限公司，批号：20161126).其他试剂：PBS磷酸缓冲液、固定液、台盼蓝染液、结晶紫染液等.

1.2 细胞复苏及活力测定

按常规方法复苏MDCK细胞，检查细胞活力达到90%以上时，用10% NBS(v/v)的DMEM培养基置培养箱(37 ℃、5%CO2、饱和湿度，下同)中培养.

1.3 细胞传代适应培养

待细胞生长至90%以上融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶4比例分别用含2%、5%、8%、10%NBCS的培养基相应地传代至3代备用.

1.4 细胞悬液的制备

0.25%胰蛋白酶分别消化细胞，用相应浓度NBCS的培养基制备细胞悬液.采用有限稀释法将细胞稀释至1×103个/mL.

1.5 低密度接种培养

取上述细胞悬液，在6孔细胞培养板(面积9.6cm2/孔)上按10个细胞 /cm2接种培养，每孔培养液为3 mL，每个血清浓度平行做3孔.

1.6 观察和计数

每2～3 d倒置相差显微镜观察集落形成的情况.当形成的集落能肉眼可见时，用结晶紫染色计数集落数目.

1.7 贴壁率的计算

依据下列公式计算细胞在不同培养基中的贴壁率.

贴壁率(%)=所形成的集落数目/接种的细胞数目×100%.

2 结果

2.1 细胞

复苏后经台盼蓝染色后记数，细胞活力达92.85%，细胞活力高、状态好.

2.2 复苏的细胞

48 h可生长较致密单层，用含2%、5%、8%、10%的新生牛血清(NBS)的培养基适应培养时细胞生长状态良好.1∶4比例传代，10%NBS的生长最快、细胞状态最好，8%NBS的次之.此两种血清浓度下培养的MDCK细胞需要在48 h传代；5%NBS和2%NBS相对较慢，72 h～84 h形成较致密单层.

2.3 低密度

接种培养后第三天镜下可见有贴壁的细胞分裂成多个，形态不规则且细胞相互间隙较大.6 d已经成小簇.簇的外观还呈不规则，两周基本形成了致密的肉眼可见的细胞大集落.集落数目和贴壁率见表1.

表1不同血清浓度下MDCK细胞集落形成数和贴壁率

3 结论与分析

评价细胞培养效果的方式很多，最常用的是细胞生长曲线、最大增殖浓度和倍增时间等，这都是在细胞接种较高、有群体效应的情况下进行的.细胞低密度培养降低了群体效应，实验结果更加真实地反映出细胞对培养液的适应情况.在GE公司提供的微载体培养手册中介绍，细胞的贴壁率是指导细胞在微载体上接种数量的关键指标.因为只有贴壁效果好，细胞才能在搅拌悬浮状态下贴壁生长.本文以低密度10个/cm2接种MDCK细胞培养，探究了2%、5%、8%、10%血清浓度对细胞培养的影响.在血清浓度为10% 时MDCK细胞贴壁率最高为74.89%，在血清浓度8%时贴壁率也达到了61%.表明该血清浓度下细胞贴壁生长效果很好，能用于生物反应器大规模培养.