水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊的处方设计

史霞飞，李 楠，毕贤双，李信科，于 青，刘东春



水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊的处方设计

史霞飞，李 楠，毕贤双，李信科，于 青，刘东春*

（沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016）

粉末直接灌装胶囊的方法制备摩尔比为1∶1的水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物（SUE0101）胶囊。采用单因素实验对填充剂和助流剂的种类和含量进行初步的筛选。以胶囊的体外溶出度和胶囊内容物的休止角为指标通过响应曲面法中的中心复合设计优化胶囊填充剂和助流剂的精确含量，填充剂和助流剂的含质量分数取值为20%～40%和0.5%～1.5%设计实验，零点重复两次，筛选出最佳用量，同样的指标筛选制备胶囊的最佳工艺。按照最优处方重复三次验证水飞蓟宾-熊去氧胆酸胶囊处方工艺的稳定性和一致性。得到最佳工艺和最优处方：乳糖含量质量分数为40%，气相二氧化硅200含量质量分数为1.25%。将最优处方的最佳工艺重复三次验证，证明胶囊的处方工艺科学、稳定、可行。成功制备出工艺稳定、安全可行的水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊。

药剂学；共无定形物；响应曲面法；水飞蓟宾；熊去氧胆酸；胶囊

在中国，肝癌是非常常见的癌症[1]。目前治疗肝病，发展趋势是走抗病毒、保肝、降酶联合治疗的道路[2]。水飞蓟宾（silybin，SLB）是一种黄酮木脂素类化合物，水溶性差。水飞蓟宾可保护肝细胞，其保肝机制为抗氧化、抗脂质过氧化、抗纤维化、细胞膜稳定作用和调节肝细胞再生能力等[3-4]。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是中药熊胆的有效成分，是一种非细胞毒性的胆汁酸，临床主要用于治疗慢性肝炎和原发性胆汁淤积性肝硬化、原发性硬化性胆管炎等各种胆汁淤积性肝病[5-6]。有临床联合应用水飞蓟宾和熊去氧胆酸治疗非酒精性脂肪型肝炎，并与单用熊去氧胆酸P[7]，或单用水飞蓟宾[8]进行比较，结果显示两者同时应用确实达到了更好的疗效。因此为了提高水飞蓟宾的体外累积溶出度及溶出速率，同时发挥二者药物的协同作用，将水飞蓟宾和熊去氧胆酸按照摩尔比1∶1的比例通过溶剂蒸发共沉淀法制备水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物（SUE0101）[9]，并且采用响应曲面法中的中心复合实验法优化胶囊辅料的含量，应用粉末直接灌装胶囊的方法制备水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊。

1 仪器与材料

ESJ182-4电子天平（沈阳龙腾电子有限公司），N-1000旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），BX51偏光显微镜（日本奥林巴斯公司），200F3差示扫描量热仪（德国耐驰公司），IFS55傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司），UV1700紫外分光光度计（日本岛津公司），MVS-1涡旋混合器（北京金北德工贸有限公司），ZRSG智能溶出测试仪（天津天大天发科技有限公司）。

水飞蓟宾（辽宁盘锦华成有限公司），熊去氧胆酸（淮北中迈生物科技有限公司），乳糖（德国美剂乐），气相二氧化硅200（赢创工业集团），无水乙醇、氢氧化钠、磷酸二氢钠（天津永大化学试剂有限公司），水（市售娃哈哈纯净水）。

2 方法与结果

2.1 水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物的制备及表征

2.1.1 水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物的制备

采用溶剂蒸发法、共沉淀法制备共无定形物。精密称取摩尔比1∶1的水飞蓟宾和熊去氧胆酸置于茄形瓶中，加入适量无水乙醇，在60 ℃水浴中使药物完全溶解。在60 ℃温度下，采用旋转蒸发仪回收溶剂。溶剂完全蒸干后，收集茄形瓶中的干燥固形物，将干燥固形物放入研钵中适当研磨，使没有结块，然后将研磨后粉末放入真空干燥器中，在30 ℃、真空度40～50 mmHg下继续减压干燥24 h。将完全干燥的样品用研砵研磨并过筛孔孔径为180 μm的标准检验筛，得到色泽均匀橙黄色粉末，4 ℃避光保存备用。制得的样品记为SUE0101。水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物的制备流程图见图1。

Fig. 1 The preparation process of silybin/ursodeoxycholic acid evaporated co-amorphous drugs

2.1.2 水飞蓟宾-熊去氧胆酸物理混合物的制备

按摩尔比1∶1精密称取SLB和UDCA，置于离心管中涡旋混合10 min，得到两者的物理混合物（physical mixture, PM）。

2.1.3 水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物的质量评价

通过蒸发共沉淀法将水飞蓟宾与熊去氧胆酸制备成共无定形物之后，体系的物相发生变化，在SUE制备过程中，有可能由于某些原因造成的工艺欠缺，那么药物和载体就有可能不能形成无定形状态的蒸发共沉淀物，相应的其物相表征也会有差异。因此本研究通过测定水飞蓟宾的体外溶出度、偏光显微镜（PLM）图、傅里叶红外（FTIR）光谱图和DSC曲线等对共无定形物进行简单评估。

2.1.3.1 SUE0101体外溶出度的测定

参考《中华人民共和国药典》2015年版二部附录XC溶出度测定第II法（桨法）进行溶出度实验。分别称取SUE0101和PM（按SLB计为15.3 mg），与麦芽糊精按质量比为4∶3混合均匀后，装入0 ♯透明胶囊中备用。溶出介质为pH值6.8的磷酸缓冲液，体积900 mL，温度(37±0.5) ℃，转速50 r∙min-1，分别在5、15、30、60、90和120 min取样，每次0.45 μm滤膜过滤后取样5 mL，置于试管中，然后补充等体积的预热至37 ℃的溶出介质。测定每个试管中样品在287 nm的吸光度，根据标准曲线求得水飞蓟宾的含量，计算SLB的累积释放度，结果见图2。

◆—SUE0101; ▲—PM

由图2可知，SUE0101的体外溶出度与PM相比表现出较快的溶出速率和较大的溶出累积释放度，样品在桨速50 r∙min-1、 pH值6.8的磷酸缓冲液中2 h累积释放可达95%以上。

2.1.3.2 傅里叶转换红外光谱（FTIR）

SLB、UDCA、PM0101、SUE0101的红外光谱及红外数据见图3和表1。

Fig. 3 FTIR spectrum of the samples

Table 1 Data of FTIR spectrum of the samples

FTIR分析是研究共沉淀后SLB和UDCA之间的键合和任何相互作用的技术。与SLB和UDCA相比，PM的吸收被简单地看作是SLB和UDCA的叠加，说明物理混合物没有显著的化学相互作用。在SLB光谱中，3 458 cm-1归属于—OH伸缩模式，两者形成共无定形物沉淀后，这一原始强度带在SUE0101中变为3 422 cm-1，表明在与UDCA共沉淀后，SLB中的—OH发生变化。

结果如图3所示，与熊去氧胆酸原药的红外图谱相比较，图谱中可以看到熊去氧胆酸中的羧基1 716 cm-1的羰基吸收峰并未发生位移, 观察到C=O伸缩振动分别红移约7 cm-1至波数1 709 cm-1处，推测在共无定形物中水飞蓟宾的羟基与熊去氧胆酸的羧基产生了氢键，因而导致1 716 cm-1处的羰基峰向低波数位移。

2.1.3.3 差示扫描量热法（DSC）

各样品的DSC结果见图4。

Fig. 4 DSC curves of the samples

DSC图中SLB在164.5 ℃有一个吸热的熔融峰，UDCA在206.68 ℃有一个吸热的熔融峰，表明两物质单体均以晶体形式存在。PM中水飞蓟宾和熊去氧胆酸的熔融峰均存在，说明两者晶态性质未发生改变。SUE0101中不见SLB和UDCA的熔融峰，说明在两者晶体形式消失，以无定型形式存在。

2.1.3.4 偏光显微镜（PLM）

各样品的PLM结果见图5。

Fig. 5 PLM micrographs of samples under normal light and polarized light

观察图5可知，SLB晶体以大小不一、形状不规则的细小晶体存在，UDCA晶体呈多棱棒状，结晶形态清晰。在SUE0101中，暗视野下两者的典型晶体形态和晶体变彩都消失，样品呈较大的不规则块状，表面较光滑。说明制备得到的物质是非晶体状态。这与共无定形物属于非晶态物质的性质一致。

2.1.3.5 粉末X射线衍射（PXRD）

PXRD结果见图6。

Fig. 6 PXRD patterns of the samples

PXRD中SLB在14.62°、19.68°、22.37°、24.53°、26.94°等位置有较强的晶体特征衍射峰；UDCA在9.47°、13.8°、18.88°、22.49°、24.86°等位置有较强的晶体特征衍射峰，说明两者具有典型的晶体结构；PM图谱中SLB和UDCA的衍射峰都还明显存在，没有新的衍射峰生成，只是叠加的状态，说明SLB和UDCA都还是以各自的晶体形式存在，SUE0101中不见两者晶体衍射峰，说明SUE0101以无定型状态存在。

2.2 水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊的处方筛选

2.2.1 胶囊的体外溶出度的测定

采用《中华人民共和国药典》2015年版第二部附录XC溶出度测定第Ⅱ法（桨法）测定。以pH值6.86磷酸盐缓冲液900 mL为溶出介质，溶出温度为（37±0.5）℃，转速为50 r∙min-1的溶出条件进行测定，分别在5、15、30、60、90和120 min取样，每次0.45 μm滤膜过滤后取样5 mL，置于试管中，然后补充等体积的预热至37℃的溶出介质，取续滤液稀释10倍。测定每个试管中样品在287 nm的吸光度，根据标准曲线求得水飞蓟宾的含量，计算SLB的累积释放度，通过测定吸光度值，计算药物的累积溶出度。

2.2.2 休止角的测定

将直径为60 mm的玻璃漏斗垂直放置在铁架台上，下部为直径约25 mm的不锈钢片，垂直放置在距漏斗下端约35 mm左右处的桌面上，使漏斗中心与不锈钢片中心一致。将样品缓缓地、均一的落入不锈钢片中心部，使落下的在粉末形成圆锥体，当样品从粉末边缘沿着不锈钢片慢慢落下时停止加样品，拍照后，用Photoshop标尺量角。

2.2.3 单因素筛选

将SUE0101作为中间体，按照每粒胶囊含水飞蓟宾140 mg进行处方设计，响应指标分别为胶囊的体外溶出度和胶囊内容物的休止角，稀释剂用量的质量分数为20%，助流剂用量的质量分数为1%，筛选出合适的稀释剂和助流剂的种类。并通过单因素考察实验，分别对所选择填充剂、助流剂的含量进行初步的筛选。

在制剂中常用的填充剂有乳糖、淀粉、微晶纤维素等。常用的助流剂有气相二氧化硅200（Aerosil 200）、硬脂酸镁、滑石粉等。设计填充剂用量的质量分数为20%～40%，助流剂用量的质量分数为0.5%～1.5%进行单因素试验。

填充剂乳糖、淀粉、微晶纤维素对体外溶出度、休止角的影响见图7和表2。

■—Formulation 1; ▲—Formulation 11;●—Formulation 12

Table 2 Angle of repose for formulations of different filler

由图7和表2可知，填充剂是乳糖时，此胶囊处方的体外溶出度最高为85.6%，并且此处方休止角最小是44.1º 。因此选择乳糖作为水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊的填充剂。接下来根据胶囊的休止角和体外溶出度对乳糖的含量进行初步的筛选，结果见表3和图8。

Table 3 The angle of repose for formulations of different lactose level

●—Formulation 1; ●—Formulation 2; ●—Formulation 8

由表3和图8可知，胶囊中乳糖含量的增加会使胶囊的体外溶出度增加，休止角减小。乳糖的含量质量分数为40%和20%时的体外溶出度曲线的相似因子68.58，即两条溶出曲线相似，故对乳糖的含量进行进一步的实验筛选。

助流剂气相二氧化硅200、硬脂酸镁、滑石粉对体外溶出度、休止角的影响见图9和表4。

■—Formulation 1;▲—Formulation 13;●—Formulation 14

Table 4 Angles of repose for different glidantformulations

由图9和表4可知，助流剂为气相二氧化硅200时，此胶囊的累积溶出度最高为85.6%，休止角为44.1º，气相二氧化硅200可用来调节自由流动和作为抗结块剂来改善粉末性质，故选择气相二氧化硅200作为水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊的助流剂。接下来根据胶囊的休止角和体外溶出度对气相二氧化硅200的含量进行初步的筛选，结果见表5和图10。

Table 5 The angle of repose for formulations of different aerosil 200 level

■—Formulation 1; ●—Formulation3;▲—Formulation9

由图10和表5可知，胶囊中气相二氧化硅200的含量增加会使胶囊的体外溶出度增加，休止角减小。气相二氧化硅200的含量质量分数为1.0%和1.5%时的体外溶出度曲线基本一致，故对气相二氧化硅200的含量进行进一步的实验筛选。

2.2.4 处方工艺研究

采用粉末直接灌装胶囊的工艺来制备水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊。具体工艺流程见图11。

Fig. 11 Flow chart of capsule preparation process

不同工艺处方的研究结果见表6和图12。

Table 6 The angle of repose of different process prescriptions

●—Processe1; ■—Processe2;▲—Processe3

根据体外溶出度和休止角综合考虑，水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形复合物胶囊的处方工艺最好的是工艺2。工艺2的休止角是44.1°，体外溶出度是87.46%，即将SUE0101、乳糖、气相二氧化硅 200 分别过180 μm筛，将SUE0101与气相二氧化硅200等量递加混匀，接下来将此混合物与乳糖等量递加混匀，将上述总混合物涡旋混匀10 min，粉末直接灌装胶囊。

2.2.5 响应曲面设计

采用中心复合设计方法，以30 min时的累积溶出度（30）和休止角（re）为考察指标，以填充剂乳糖的含量（1）和助流剂气相二氧化硅200的含量（2）2个因素为自变量，其取值范围的质量分数分别设为20%～40%，0.5%～1.5%设计实验，重复零点两次，用来估计实验误差，因素水平表见表7。

Table 7 The factors and levels selected

响应曲面设计实验结果见表8。

Table 8 Response surface design and test results

用JMP10.0软件对上表30提取相关的数据进行最小二乘拟合。并对该模型进行拟合汇总与方差分析，30实际值对预测值的结果见图13，排序后的参数估计值见表9。

Fig. 13 The figure of the actual value to the predictive value of Y30(P=0.000 9, RSq=0.99, RMSE=2.059)

根据各参数估计值，将其带入数学模型公式：=b0+ b1•1+ b2•2+ b4•1•2+b7•12+ b8•22得30的预测公式：1=45.838+10.5821+6.148 62-6.029 81•+5.589 512-4.083 322。

Table 9 Regression coefficient and significance test of Y30

Note: *—Implies a significant impact on

回归方差分析显著性检验表明，乳糖的量、气相二氧化硅200的量对30都有较显著影响，乳糖的量与气相二氧化硅200的量之间交互作用显著。在本实验设计范围内，该模型回归显著(< 0.05)。模型的复相关系数为0.99，说明该模型能解释99% 响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，试验误差小，证明应用响应曲面法优化胶囊中乳糖的用量是可行的。

用JMP10.0软件对上表re提取相关的数据进行最小二乘拟合。并对该模型进行拟合汇总与方差分析，Bre实际值对预测值的结果见图14，排序后的参数估计值见表10。

Fig. 14 The figure of the actual value to the predictive value of αre (P=0.0148, RSq=094,RMSE=6 219)

根据各参数估计值，将其带入数学模型公式=b0+ b1•1+ b2•2+ b4•1•2+b7•12+ b8•22得re的预测公式：1=44.057-0.933 31-1.766 72+ 0.2251•2-0.114 312+0.185 722。

Table 10 The estimation of parameters of each factor of αreB

Note: *—Implies a significant impact on

回归方差分析显著性检验表明，乳糖的量与气相二氧化硅200的量对re都有显著影响，乳糖的量与气相二氧化硅200的量之间交互作用不明显。在本实验设计范围内，该模型回归显著(＜0.05)。re模型的复相关系数为0.94，说明该模型能解释94%的响应值变化，即该模型与实际实验模拟良好，实验误差小，证明应用响应曲面法优化的休止角是合理可行的。

乳糖和气相二氧化硅200的量的响应曲面图见图15。

A—Y30; B—αre

用预测刻画器对乳糖的量和气相二氧化硅200的量最优条件进行预测，得出乳糖的量和气相二氧化硅200的量分别的最优条件以及共同的最佳条件。各因素对指标的预测效应面图见图16。

Fig. 16 The figure of predictive values of the assessing indexes and factors

图16中曲面的最大点，即两个主要因素的最佳水平值，转换后可以得到乳糖与气相二氧化硅200含量的最佳点。经过软件处理与计算，响应B30最佳的辅料组成是乳糖的质量分数为40%，气相二氧化硅200的质量分数为1%。响应re最佳的辅料组成是乳糖的质量分数为40%，气相二氧化硅200的质量分数是1.5%。故二者共同的最佳的辅料组成为：乳糖含量质量分数40%，气相二氧化硅200含量质量分数1.25%。

对胶囊的最佳处方进行验证，重复3次，30 min的体外溶出度分别为63.0%、62.1%和62.0%，休止角的得率分别为43.0°、42.7°和42.0°，都在预测范围内。

3 结论

本文作者运用粉末直接灌装的方法成功制备水飞蓟宾-熊去氧胆酸共无定形物胶囊。采用响应曲面法中的中心复合设计法，以胶囊的体外溶出度和胶囊内容物粉末的休止角为响应，考察得到胶囊中乳糖和气相二氧化硅200的最佳含量即乳糖的含量质量分数为40%，气相二氧化硅的含量质量分数为1.25%，且乳糖含量、气相二氧化硅含量对累积溶出度和休止角都有显著影响。三次重复试验验证实验结果表明，在本实验条件范围内建立的响应曲面设计科学、经济、可行。根据胶囊的体外溶出度和休止角确定胶囊的最佳工艺即：将SUE0101、乳糖、气相二氧化硅200 分别过筛孔孔径为180 μm的标准检验筛，将SUE0101与气相二氧化硅200等量递加混匀，接下来将此混合物与乳糖等量递加混匀，将上述总混合物涡旋混匀10 min，粉末直接灌装胶囊。

[1] WANG F S, FAN J G, ZHANG Z, et al. The global burden of liver disease: the major impact of China[J]. Hepatology, 2014, 60(6): 2099-2108.

[2] 王绍钧, 张慜鋆. 肝病药物的应用分析[J]. 临床医药实践, 2010, 19(8): 433-435.

[3] 王红军, 姜嫒媛, 路平, 等. 水飞蓟宾的抗肿瘤、抗氧化和免疫调节分子药理学机制研究进展[J]. 药学学报, 2010, 45(4): 413-421.

[4] 陈红, 苏定冯. 水飞蓟宾的药理作用[J]. 药学实践杂志, 1991, 28(3): 7-9.

[5] ROMA M G, TOLEDO F D, BOAGLIO A C, et al. Ursodeoxycholic acid in cholestasis: linking action mechanisms to therapeutic applications [J]. Clin Sci, 2011, 121(11/12): 523-544.

[6] ISHIZAKI K, IMADA T, TSURUFUJIM. Hepatoprotective bile acid ursodeoxycholic acid (UDCA)' Property and difference as bile acids[J]. Hepatol Res, 2005, 33(2): 174-177.

[7] 王琳. 熊去氧胆酸胶囊联合水飞蓟宾胶囊治疗原发性胆汁性肝硬化30例[J]. 中国医药指南, 2016, 14(19): 118-119.

[8] 徐洪滨. 熊去氧胆酸联合水飞蓟宾胶囊治疗非酒精性脂肪肝病的临床效果观察[J]. 中国医药指南, 2018, 16(1): 73-74.

[9] 刘东春, 王芳, 王东, 等. 一种水飞蓟宾-熊去氧胆酸的固体分散体及其制备方法[P]. 201210208426. 2013-07-10.

[10] 岑菁, 袁志翔, 徐超群, 等. 水飞蓟宾分散片的制备及体外溶出度研究[J]. 华西药学杂志, 2013, 28(2): 121-123.

[11] KAISER S, VERZA S G, MORAES R C, et al. Extraction optimization of polyphenols, oxindole alkaloids and quinovic acid glycosides from cat's claw bark by Box–Behnken design[J]. Industrial Crops & Products, 2013, 48: 153-161.

Formulation design of silybin-ursodeoxycholic acid co-amorphous capsule

SHI Xiafei, LI Nan, BI Xianshuang, LI Xinke, YU Qing, LIU Dongchun*

(,，110016，)

To prepare capsule by directly filling powder into capsule, the silybin- ursodeoxycholic acid co-amorphous(SUE0101) powder is used as an intermediate.Through a single-factor experiment, according thedissolution and the angle of repose of capsule content，the type and content of filler and glidant were preliminary screened. Using the central composite design method of response surface methodology, the experiment was conducted with the filler and glidant ranging from 20% to 40% and 0.5% to 1.5% and was repeated twice at zero. According thedissolution and the angle of repose of capsule content, the best preparation process was confirmed.The best formulation was 40% of lactose and 1.25% of aerosol 200. SUE 0101, lactose, and aerosil200 were passed through an 80-mesh sieve, respectively. SUE0101 and aerosol 200 were added in equal amounts. The mixture was then mixed with lactose added by equal amounts, and the above total mixture was vortexed for 10 min. Silybin-ursodeoxycholic acid co-amorphous capsules were finally prepared.The silybin-ursodeoxycholic acid co-amorphous capsule is successfully prepared, and the preparation process of capsule is stable and feasible.

pharmaceutics; co-amorphous; response surface methodology; silybin; ursodeoxy- cholicacid; capsule

（2018）05–0069–15

10.14146/j.cnki.cjp.2018.05.001

R94

A

2018-06-26

史霞飞(1991-), 女(汉族), 山东日照人, 硕士, 主要从事中药制剂学研究, Tel. 13156209525, E-mail shixiafei123@163.com;

刘东春(1971-), 男(朝鲜族), 辽宁沈阳人, 副教授, 硕士生导师, 主要从事中药制剂学研究, Tel. 13889108973, E-mail liudongchun@outlook.com。

(本篇责任编辑：赵桂芝)