酒糟黄水中二肽和环二肽的研究

2018-10-30廖勤俭安明哲李杨华周韩玲王小琴

酿酒科技 2018年10期

廖勤俭，安明哲，李杨华，周韩玲，王小琴，王芳，郭艳

（宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾644007）

二肽是由2个氨基酸通过一个肽键缩合而成的最小的肽，其两端的氨基和羧基在一定条件下可以再次肽键缩合而成稳定的环二肽。因其结构简单，分子量小，所以能够通过细胞膜的渗透以原形直接进入细胞内，参与细胞的生长、发育、生理功能等。目前有许多对环二肽类化合物的研究报道，并发现许多的环二肽类化合物具有生物活性，钟飞等[1]对近年来生物活性环二肽的发现及合成策略进行了综述，并总结出环二肽在自然界及天然产物中广泛存在；卢曦元等[2]对环二肽在胞间信息传递、抑制毒素、促癌细胞凋亡和镇痛作用方面也进行了综述。

酒糟黄水，是固态白酒发酵过程中酒糟的浸出液，属于固态白酒酿造的副产物，其中含有丰富的微生物、糖类、蛋白质降解物、微生物代谢产物、白酒的香味成分等。酒糟黄水中的蛋白，一部分来自于粮食原料，一部分来自微生物菌体，包括微生物蛋白和植物蛋白，在微生物及酸的作用下降解成小分子的肽。同时，酒糟黄水具有酒糟中的相似成分，五粮浓香型白酒特有的蒸馏方式，使得在白酒蒸馏过程中，酒糟中难挥发和不挥发的组分也会随着蒸汽经精馏塔似的酒糟层，带入白酒中，如具有生物活性的环二肽类化合物，笔者此前也进行了白酒中环二肽类化合物的研究，并检出其中的13种环二肽[3]。在传统的中医药理中，酒有白药之长的说法，合理使用能有效提高中药疗效。因此，将白酒与医学保健相联系，研究酒糟黄水中的二肽及环二肽类生物活性成分，对于深入研究白酒中的生物活性成分，阐述这些生物活性物质的生理活性，能够对适量饮酒促进健康的观点提供理论依据，对于酒糟黄水的回收利用也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

酒糟黄水：取自五粮液技术研究中心。

美国Agilent公司1290系列高效液相色谱仪(HPLC)，6520B系列质谱检测器（Q-TOF），Agilent MassHunter数据采集工作软件、定性定量分析软件。

制备色谱（GX-281）。

旋转蒸发仪（Heizbad Hei-VAP）。

1.2 色谱条件

分析柱：Agilent Eclipse Plus C182.1×100 mm 1.8-micron。

流动相：甲醇B（液质级），超纯水A（含0.05%甲酸），0～15 min：5B-100B；15.1～20 min；100B；20.1 min；5B；22 min：stop。

柱温：30℃。

流速：0.2 mL/min。

进样体积：2 μL。

1.3 质谱条件

离子源：DESI源,正模式。

Gas Temp：325℃。

Drying Gas：10 L/min。

Nebulizer：40 psig。

Vcap：4000 v。

Fragmentor：60 v。

1.4 样品处理

取酒糟黄水，旋转蒸发浓缩成膏状，用无水乙醇沉淀后，取上清液，膜过滤，滤液经制备色谱分离，分段收集，收集液作为待测样品。

2 结果与分析

2.1 氨基酸的二级特征离子

取各氨基酸，分别用甲酸水溶液配制成浓度为1000 mg/L，进行目标离子扫描模式，进行每个氨基酸的二级质谱特征离子确定。各氨基酸对应的分子离子、二级碎片特征离子见表1。

2.2 黄水样品的制备分离

经乙醇沉淀的黄水样品，进样5 mL，以10 mL/min的流速乙醇水梯度洗脱，按时间收集（1 min/个）。

2.3 样品中二肽和环二肽类化合物的质谱定性检测

表1 氨基酸对应的分子离子、二级碎片特征离子

利用LC-QTOF，分析检测各制备分离收集的样品，先对各样品进行全扫描，找出具有二肽和环二肽特征的目标离子，再针对目标离子进行targetms方式进行二级质谱图检测，以确定其结构式。检测结果见表2，各化合物的二级质谱图见图1—图32。

表2 各目标化合物分子式、分子离子和二级碎片特征离子

图1 Val-Ala

3 结论

由每个氨基酸碎片特征离子可以看出，氨基酸在20 eV碰撞能量下的断裂方式具有规律性，从其一端的-COOH和-NH3上的-H断裂，造成46 Da质量数的丢失。环二肽在20 eV碰撞能量下的特征碎片离子与其含有的两个氨基酸的特征碎片离子一致，由此，以氨基酸特征碎片离子解析定性二肽及环二肽类化合物具有可行性和准确性。

图2 Leu-Gly

图3 Pro-Val

图4 Leu-Ala

图5 Val-Tyr

图6 Pro-Ala

图7 Leu-Phe

图8 Pro-Leu

图9 Val-Leu

通过对酒糟黄水中样品的浓缩、萃取、制备色谱分离等前处理方式，利用高分辨高效液相色谱质谱（LC-QTOF）分析检测，共分离检测出二肽和环二肽化合物32种，分别是Val-Ala，Leu-Gly，Pro-Val，Leu-Ala，Val-Tyr，Pro-Ala，Leu-Phe，Pro-Leu，Val-Leu，Pro-Phe，Val-Phe，Leu-Leu，Cyclo(Pro-Val)，Cyclo(Glu-Leu)，Cyclo(Glu-Phe)，Cyclo(Pro-Leu)，Cyclo(Ileu-Leu)，Cyclo(Pro-Phe)，Cyclo(Val-Phe)，Cyclo(Pro-Pro)，Cyclo(Val-Val)，Cyclo(Leu-Ala)，Cyclo(Val-Ala)，Cyclo(Val-Leu)，Cyclo(Phe-Phe)，Cyclo(Leu-Phe)，Cyclo(Pro-Ala)，Cyclo(Pro-Glu)，Cyclo(Pro-Tyr)，Cyclo(Pro-Thr)，Cyclo(Phe-Ala)，Cyclo(Leu-Leu)。大部分二肽都能找出对应的环二肽，其中3种没有检出对应的环二肽，可能与预处理方式有关。

图10 Pro-Phe

图11 Val-Phe

图12 Leu-Leu

图13 Cyclo(Pro-Val)

图14 Cyclo(Glu-Leu)

图15 Cyclo(Glu-Phe)

图16 Cyclo(Pro-Leu)

图17 Cyclo(Ileu-Leu)

图18 Cyclo(Pro-Phe)

图19 Cyclo(Val-Phe)

图20 Cyclo(Pro-Pro)

图21 Cyclo(Val-Val)

图22 Cyclo(Leu-Ala)

图23 Cyclo(Val-Ala)

图24 Cyclo(Val-Leu)

图25 Cyclo(Phe-Phe)

王艾晶等[4]从洋葱伯克霍尔德菌CF-66发酵液中分离得到的Cyclo(Pro-Phe)对真菌类病原菌具有强烈的抑制作用。Brauns等[5]验证了Cyclo(Pro-Phe)在结肠癌HT-29细胞中的抑制生长的原因。从海洋放线菌H2003代谢产物中分离得到的Cyclo(L-Pro-L-Leu)对小鼠FT210细胞株具有弱的抗肿瘤活性[5]。李德海等[6]对海洋放线菌发酵物中生物活性成分的研究发现，环Cyclo(Leu-Ala)、Cyclo(Pro-Val)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Pro-Phe)等6种环二肽化合物具有较弱的抗肿瘤活性。可见酒糟黄水中含有较多具有抑菌活性和抗肿瘤活性的环二肽，将酒糟黄水中的环二肽类化合物分离提取并应用具有可行性。