非对称流场流技术分离生活污水中纳米颗粒物的参数优化

孙 池，张 波，何义亮

(上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240)

纳米颗粒物是指至少在一维上尺寸为1～100 nm的晶态或无定型物质，其环境行为近年来引起了环境学领域的广泛关注[1-3]。由于巨大的比表面积和表面活性，纳米颗粒极易与水中的污染物相结合,从而大大增强污染物在水环境中的迁移能力[4-6],因此,纳米颗粒物被认为是影响环境中化学污染物迁移和生物利用度的关键因素之一[7-8]。纳米颗粒的尺寸效应使纳米颗粒更容易进入水生生物体内并富集，进而进入到食物链中[9]。纳米颗粒物的自由基氧化损伤及氧化应激效应，会对生物体造成细胞破裂、蛋白质变形、干扰基因表达、加快机体衰老等[10-12]危害，因此,其存在本身就会对生物体产生威胁[13-14]。

污水的排放是水体内众多污染物的重要来源，研究污水中纳米颗粒物与污染物的相互作用及纳米颗粒物本身的危害具有重要意义。纳米颗粒物的分离通常是研究纳米颗粒的首要步骤。在环境领域中，纳米颗粒物分离后，通常会对其在不同粒径范围内的组分差别及与其他污染物的相互作用等问题进行研究，因此需要找到一种能准确表征和分离颗粒物，且对颗粒物本身不造成损伤的分离技术[15-17]。传统分离方法中，萃取法会在纳米颗粒物中混入有机溶剂[18]，对纳米颗粒物造成污染；电泳法需要在分离过程中加入表面活性剂，活性剂会部分吸附在纳米颗粒物表面，从而影响颗粒物结构[19-20]；色谱法采用有机溶剂作为流动相，会对纳米颗粒物结构产生一定程度的破坏[21-23]。上述3种方法都很难对不同粒径级别的纳米颗粒物实现分离。传统的颗粒物粒径表征技术有扫描电镜(SEM)和动态光散射(DLS)。SEM由于观察区域小，检测的颗粒粒径不具有统计学意义，且拍摄前样品的干燥处理会对样品造成一定程度的损伤；动态光散射(DLS)技术中，大颗粒布朗运动的缓慢性会使散射光斑产生缓慢波动，对大颗粒物的粒径表征误差较大；非对称流场流分离技术采用流体力学原理，较传统颗粒物粒径表征技术具有更高的准确度和最大程度保留样品特性的优点[24]。该技术是一种采用开放式通道的尺寸分级技术，可以根据扩散系数的差异分离颗粒物[25]。 AF4在分离不同尺寸的颗粒物时几乎是一种通用型方法，在一定的参数设置并采用不同洗脱溶剂的条件下可分离1～500 nm的聚集体，其流动相允许使用离子强度高达10 mmol/L的去离子水或缓冲水溶液[25]，而不添加其他如表面活性剂等流动相改性剂，因此不会影响颗粒尺寸和表面电荷[26]。同时，AF4也可串联其他的检测设备，如UV、ICP以及颗粒物尺寸的表征设备，显著提高了AF4的适用范围和功能性[27-28]。目前对蛋白质、病毒、C60、纳米银等多种标准纳米颗粒物的分离表征案例较多[17,29-30]，而实际水样中，纳米颗粒物由于浓度低、成分复杂等特征，目前鲜有报道过对其分离的研究，其分离难点在于实际水样的预处理、非对称流场流分析仪的仪器参数设置和分离条件的选择。

本研究采用污水厂进水作为样品，构建使用AF4分离污水样品中纳米颗粒物的预处理方法，考察各分离条件对分离效果的影响和分离条件的选择优化，以期为污水和实际水体中纳米颗粒物的分离建立一套系统的分离方法，为后续水体中纳米颗粒物的成分分析及研究纳米颗粒物对污染物迁移的影响提供参考依据。

1 试验和方法

1.1 原料和仪器

所有的溶液均采用日本HITACHI公司的超纯水(18.2 MΩ·cm)配制，NaCl(分析纯，国药)，0.1 μm混合纤维素膜(KMCE0150100，Millipore，美国)，0.22 μm混合纤维素膜(KMCE02250100，Millipore，美国)，0.45 μm混合纤维素膜(KMCE04570100，Millipore，美国)，再生纤维素膜(5、10、30 kDa，Wyatt Technology Corp.，美国)，超滤杯(8400，Millipore，美国)。

本研究采用的非对称流场流分析仪(AF4，Wyatt Technology Corp.，美国)，配置有高压力自动进样器。载流液通过高效液相色谱(G1311A，Agilent，美国)中的1260 Iso泵控制。样品经AF4分离进入MALS检测，数据通过软件ASTRA 6.1(Wyatt Technology Corp.，美国)收集处理。

1.2 水样的采集与预处理

采集的污水来自上海某污水厂进水口，污水置于10 L聚乙烯瓶中，于4 ℃ 冷库中储存。污水经0.45 μm混合纤维素膜过滤以除去污水中的悬浮物。过滤水中的纳米颗粒物浓度较低，为提高检测精度，过滤水在进入AF4前需采用超滤杯浓缩100倍，超滤膜采用10 kDa再生纤维素膜。为保证样品处于纳米级(1～100 nm)，样品需再经0.1 μm混合纤维素膜过滤。

1.3 AF4分离实际样品纳米颗粒物的参数优化

AF4是由Wahlund等[31]设计的一种新型场流分离系统。系统中分离流道的外场力是垂直于流动方向上的交叉流。流道的底部是多孔选择性渗透膜，仅允许溶剂分子通过，可以支持颗粒物在流道中的分离。如图1所示，由于布朗运动，样品会往分离通道的中心线方向扩散。颗粒物尺寸越小，扩散系数越大，其在流道中的位置会越靠近中心线，从而拥有较高的流速，在分离过程中被较早洗脱出来。

图1 非对称流场流分离原理Fig.1 Principle of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation

样品的净保留时间(tR，s)与其水力学半径(Rh，m)有关。样品保留时间取决于其扩散系数(D，m2/s)。净保留时间和扩散系数之间的关系为Nernst-Einstein扩散方程,如式(1)。

(1)

其中：w—分离通道的厚度，m；

Fcr—交叉流流速，mL/min；

Fout—水平流流速,mL/min。

在扩散系数已知的情况下，水力学半径可通过Stokes-Einstein方程计算,如式(2)。

(2)

其中：kB—Boltzmann常数，J/K；

T—绝对温度，K；

η—载流液的动力学黏度，Pa·s。

水力学半径与净保留时间的关系式(3)可以由式(1)和式(2)推导出来。

(3)

由上述非对称场流仪的分离原理可知,进样量、水平流速、交叉流流速和洗脱时间对分离效果有重要影响。这3个因素决定样品峰的特征各不相同，且分离效果难以量化，并不适宜采用正交试验决定最优参数。本研究采用各因素逐一试验来决定最优分离条件。进样量依次采用100 μL、1 mL，水平流速依次采用0.5、1、2、3 mL/min，交叉流流速依次设为0.5、1、1.5、2 mL/min，洗脱时间根据实际出峰情况选定。其他条件采用经验值或暂定值：进样流速通常采用0.2 mL/min，进样时间根据进样量和进样流速进行相应设置，聚焦流速通常采用2 mL/min,聚焦时间设为2 min,载流液浓度通常为10 mmol[32],分离膜暂用10 kDa再生纤维素膜。

1.4 分离膜孔径的优化

AF4常用的分离膜有再生纤维素膜和聚醚砜膜两种，但聚醚砜膜由于稳定性较差[16]，长期浸泡会导致膜厚度增加，从而造成分离通道厚度减小，挤压颗粒物在通道纵向的分布空间，进而降低分离效果。在相同粒径规格下，再生纤维素膜较聚醚砜膜价格更为低廉，且分离污水中纳米颗粒物的效果相差不大。综合考虑膜特性和经济性，本研究分离膜采用再生纤维素膜。本研究分别采用孔径为5、10 kDa和30 kDa的再生纤维素膜对样品进行分离，以选取最优分离膜孔径。

2 结果与讨论

2.1 进样量、水平流速、交叉流速及洗脱时间的条件优化

水平流速为0.5 mL/min，洗脱时间为50 min，交叉流速为1 mL/min时，进样量分别为100 μL和1 mL的分离效果如图2所示。

由图2可知，在分离时间为10 min附近，出现一个峰值较小的峰。这是因为在10 min时，分离模式产生变化，施加了交叉流，分离通道出现瞬间短时的扰动，出现空白峰，并非是纳米颗粒在此处洗脱出来。进样量为100 μL时，样品峰形态良好，但在进样量为1 mL时，由于样品颗粒物浓度较大，峰值部分已超过MALS的检测量程，出现平头峰，峰值信息缺失，因此本研究采用100 μL进样环。部分研究需要对流出检测器的馏分进行收集，此时较高的颗粒物浓度便于后续的分析手段对颗粒物进行表征分析，该情况下可适当稀释样品，同样可以使用1 mL进样环。

其他条件不变，水平流速为0.5、1、2、3 mL/min条件下的分离效果如图3所示。

由图3可知，样品的出峰时间会随着水平流速的增大而减小。这是由于较大的水平流速能使颗粒物较早地从分离通道中洗脱出来，从而缩短出峰时间，但水平流速大于2 mL/min时，洗脱时间不会出现较大变化，相反由于水平流速过大，样品无法在聚焦阶段实现对样品颗粒物的完全聚集，一部分颗粒物会被提早洗脱出来，从而出现较高的空白峰，造成样品峰的部分信息缺失。综合样品的洗脱时间和样品峰的完整度，最优水平流速采用2 mL/min。

在已优化条件下，交叉流采用0.5、1、2 mL/min和4 mL/min的分离效果如图4所示。

图2 进样量对分离效果的影响Fig.2 Effect of Injection Volume on Separation Efficiency

图3 水平流流速对分离效果的影响Fig.3 Effect of Horizontal Flow Rate on Separation Efficiency

图4 交叉流流速对分离效果的影响Fig.4 Effect of Cross Flow Rate on Separation Efficiency

图5 分离膜孔径对分离效果的影响Fig.5 Effect of Separation Membrane Pore Size on Separation Efficiency

由图4可知，当交叉流从0.5 mL/min增大到2 mL/min时，样品峰峰宽逐渐增大；当交叉流增大到4 mL/min时，样品峰峰高出现明显降低。这是因为样品峰增大时，不同粒径级别的颗粒物在流道中分布的差异性也会增大，颗粒物在垂直于流道方向上的分布更为分散，从而有更宽的出峰时间，但过高的交叉流流速会使部分较大尺寸的颗粒集中分布在分离膜表面，使较大尺寸颗粒物的分布差异性减小,甚至会使部分样品黏附在半透膜上，造成膜堵塞型膜污染[33]，非但不能增加样品峰峰宽，还会降低样品回收率并缩短分离膜的使用寿命。因为本研究交叉流的最优流速选用2 mL/min。

洗脱时间的设置需要保证样品峰能完全洗脱出来，如图4所示，样品峰在45 min时已显示完全，为提高分离效率，洗脱时间采用35 min。

2.2 再生纤维素膜孔径的选用

采用2.1的优化条件，不同孔径分离膜的分离效果如图5所示。

由图5可知，采用不同孔径的分离膜时，样品峰无明显区别，采用ASTRA软件对不同粒径的颗粒物数量浓度进行分析，结果如图6所示。

图6 分离膜孔径对不同粒径级颗粒物数量浓度的影响Fig.6 Effect of Separation Membrane Pore Size on Particle Number Density of Different Sizes

结果表明，当分离膜孔径为30 kDa时，颗粒物在小尺寸下的数量浓度有明显降低。这是由于在垂直于水平方向的交叉流作用下，一部分较小尺寸的颗粒物会透过分离膜被提前洗脱出来，造成颗粒物损失。在孔径为5 kDa和10 kDa时，各孔径级别颗粒物的数量浓度差异不大，但10 kDa分离膜价格相对5 kDa分离膜价格更低，因此本研究选择10 kDa为再生纤维素膜的最优分离孔径。

3 结论与展望

3.1 结论

(1)非对称场流仪能够实现对污水中纳米颗粒的分离，分离的最优条件：进样量为100 μL,水平流流速为1 mL/min，交叉流流速为2 mL/min，洗脱时间为40 min，分离膜采用10 kDa再生纤维素膜。

(2)水平流流速增大，可以加速样品的洗脱；交叉流流速增大，可以增大样品峰峰宽；分离膜孔径过大会使部分小尺寸颗粒损失；载流液盐浓度增大会缩短样品的洗脱时间。

3.2 展望

纳米颗粒物的环境负效应和在环境中的大量排放引起了学术界的广泛研究和关注。本研究聚焦于污水中的纳米颗粒，并以AF4为基础建立了水环境中纳米颗粒的分离方法，研究了AF4的关键参数对水环境中纳米颗粒分离的影响。纳米颗粒的分离是研究纳米颗粒的基础，该方法不仅可以分离污水中的纳米颗粒，也能实现实际水体中纳米颗粒的分离，为后续对纳米颗粒的定量、识别以及与污染物的相互作用提供重要的参考依据。