Zileuton对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的影响研究

谢赛阳, 罗 梅, 吴青青, 魏 丽, 陈娇娇, 邓 伟,

(武汉大学1人民医院心内科， 2心血管病研究所， 武汉 430060； 3新疆医科大学第五附属医院心内科， 乌鲁木齐 830011；4武汉大学人民医院儿科， 武汉 430060)

心肌重构是心力衰竭发生、发展的病理基础，其初始是心脏为了适应增加的血流动力学需求的一种代偿机制，在临床上属于心力衰竭发展的B期，即有心脏结构的改变，但心功能正常，它以心肌细胞肥大和心肌纤维化为特征。随着代偿作用的增加，心肌细胞肥大过度使心肌收缩力下降，而心肌纤维化加剧又使心肌舒张功能受限，临床上进展到心力衰竭的C期，即心功能下降和心力衰竭发生。现有的心衰治疗药物即使充分使用，仍有相当数量的患者疗效和预后不佳[1]。中国心血管病报告(2017)显示中国有450万心力衰竭患者[2]，而且随着中国社会人口老龄化进程加速和高血压、冠心病等各种前驱疾病的流行，心力衰竭发生预计持续增加。因此，寻找可能更有效的治疗靶点抑制甚至逆转心肌重构、防止心力衰竭发生显得尤为迫切。

炎症因子及免疫信号通路在心肌重构中发挥了重要作用，但免疫趋化因子白三烯及其相关通路蛋白是否在心肌重构中发挥了作用尚不清楚。5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase, 5-LOX)是机体白三烯合成的关键酶，既往对5-LOX在心血管疾病中的作用研究集中在动脉粥样硬化和冠心病[3-5]，但5-LOX对心肌重构的影响国内外报道极少。在本研究中，笔者应用5-LOX 特异性抑制剂Zileuton干预AngⅡ诱导的新生大鼠心肌细胞肥大，拟探讨Zileuton对心肌细胞病理性肥大的影响。

1 材料与方法

1.1细胞准备无菌操作取出SD大鼠乳鼠(1～3 d)心脏，D-Hanks液冲洗，将心室剪碎，0.125%胰蛋白酶分次消化，用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液悬浮分散细胞，并接种到6孔板中(多聚赖氨酸包被)，CO2培养箱内培养(37℃、5%CO2)。1.5 h后更换培养板，分离先贴壁的成纤维细胞。以α-actin鉴定心肌细胞纯度。

1.2主要试剂及仪器Zileuton(纯度98%,南京康满林生物科技有限公司)，Ang Ⅱ(美国SigmaAldrich公司)，胎牛血清和DMEM/F12培养液(美国Gibco公司)，RCL2液(法国Alphelys公司)，α-actinin抗体(美国Millipore公司)，羊抗鼠IgG二抗(美国Invitrogen公司)，TRIZOL和反转录试剂盒(瑞士Roche公司)。荧光显微镜(日本奥林巴斯公司产BX51TRF型)，数字定量成像系统为美国Media Cybernetics公司的Image-Pro Plus version 6.0软件，分光光度计(美国Bio-Rad公司)，LightCycler 480 SYBR○RGreen 1 Master Mix(瑞士Roche公司)。

1.3实验分组浓度观察实验分为6组：对照组(Control组)、Ang Ⅱ组、AngⅡ+Zileuton 1 μM组、AngⅡ+Zileuton 10 μM组、AngⅡ+Zileuton 50 μM组、AngⅡ+Zileuton 100 μM组。

1.4心肌细胞表面积观察参考文献[6],用α-actinin免疫荧光染色后显微镜下观察并计算单个心肌细胞表面积。步骤简述如下：PBS清洗细胞爬片后用RCL2液固定，PBS漂洗，用0.2%Triton X-100处理，PBS漂洗，使用α-actinin抗体孵育，PBS漂洗，滴加Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG二抗，PBS漂洗，用含SlowFade Gold抗淬灭剂的DAPI封片，将封片后的细胞爬片正面放置在荧光显微镜下拍照存档，用数字定量成像系统测量每组单个心肌细胞的面积。

1.5Realtime-PCRReal time-PCR法检测各组心肌细胞肥大标志物心房利钠肽(ANP)、B型脑钠肽(BNP)、心肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达变化。参考文献[6]，用TRIZOL法提取心肌细胞总RNA，并由分光光度计A260/A280以及A230/A260比率评估RNA提取质量。使用反转录试剂盒将每组2 μg RNA反转录为cDNA，并采用LightCycler 480 SYBR○RGreen 1 Master Mix进行扩增后同自身GAPDH比较，得出标准化比值。

2 结果

2.1不同浓度Zileuton对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的抑制作用CCK8法检测显示各浓度(1、10、50、100 μM)Zileuton对心肌细胞活性没有影响(P>0.05)。使用不同浓度Zileuton(1、10、50、100 μM)和AngⅡ(1 μM)共同孵育心肌细胞12 h后，α-actinin免疫荧光染色，显微镜下(400倍)计算心肌细胞表面积(cellsurface area，CSA)后计算平均值，每组分析40个细胞。结果显示，在Ang Ⅱ诱导下心肌细胞表面积明显增加(P<0.05)，而Zileuton能够浓度依赖性缓解Ang Ⅱ诱导的心肌细胞表面积增加(P<0.05)，且在浓度在50 μM时细胞肥大程度得到最大程度改善(图1)。

2.2不同浓度Zileuton对AngⅡ诱导心肌细胞肥大分子标志物的影响应用Real time-PCR方法检测不同浓度Zileuton对Ang Ⅱ诱导心肌细胞肥大标志物ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达变化的影响。结果显示，干预12 h后，10、50、100 μM浓度的Zileuton均能明显抑制Ang Ⅱ诱导的ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达增加。结果以进一步证实Zileuton对Ang Ⅱ诱导的心肌细胞病理性肥大具有抑制作用(P<0.05)(图2)。

2.3不同时间点Zileuton对AngⅡ诱导心肌细胞肥大分子标志物的影响选择50 μM浓度Zileuton，应用Real time-PCR方法检测不同干预时间Zileuton对Ang Ⅱ诱导心肌细胞肥大标志物ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达的影响。结果显示，在干预的6、12、24 h，Zileuton均能明显抑制AngⅡ诱导的ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达增加(P<0.05)(图3)。

图1 不同浓度Zileuton对Ang Ⅱ诱导心肌细胞肥大的影响

图2 不同浓度Zileuton对Ang Ⅱ诱导心肌细胞肥大标志物mRNA表达的影响

图3 不同时间点Zileuton对Ang Ⅱ诱导心肌细胞肥大标志物mRNA表达的影响

3 讨论

本研究发现，5-LOX特异性抑制剂Zileuton能够缓解Ang Ⅱ诱导的新生大鼠心肌细胞病理性肥大，同时从药物浓度和Ang Ⅱ诱导时间两方面验证Zileuton能够减少心肌细胞肥大标志物的mRNA表达。本研究从病理形态学和分子标志物两方面证实了Zileuton能够抑制心肌重构过程中的心肌细胞肥大。

5-LOX属于氧化还原酶，是一种含非血红素铁的蛋白质，在心脏中表达丰富[7]，其经典作用是免疫趋化因子白三烯合成的限速酶[8]。而大量研究也发现，5-LOX不仅促进白三烯生成，参与免疫应答，其表达增加能够促进活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，激活相关信号通路，加重组织的氧化应激损伤[9-11]。5-LOX基因敲除和使用5-LOX抑制剂AA861的小鼠较对照组小鼠展现出更快的伤口愈合能力和上调的抗氧化成分血红素加氧酶-1(HO-1)，而抑制HO-1则破坏了这种伤口快速愈合能力；体外实验中， 5-LOX抑制剂AA861同样明显减少了人皮肤纤维母细胞ROS的产生；研究说明下调5-LOX能够通过抑制过度的氧化应激促进伤口恢复。高浓度的高金雀花碱能够激活原代肌细胞的5-LOX，使胞内ROS产生增加，同时烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶表达上调， 5-LOX特异性抑制剂Zileuton能够增加胞内N-乙酰半胱氨酸的生成而减少高金雀花碱诱导的ROS增加，缓解原代肌细胞损伤。基因敲除和药物抑制5-LOX显著缓解了过量对乙酰氨基酚造成的小鼠肝损伤，包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平下降，肝组织坏死减少，同时可以发现肝组织抗氧化成分谷胱甘肽(GSH)含量增加而过氧化物含量减少。本研究证实，5-LOX特异性抑制剂Zileuton可以不通过招募外来的炎症因子和免疫细胞，而是直接作用于心肌细胞，发挥抗心肌细胞肥大效应。氧化应激与心肌重构关系密切[12-14]。5-LOX特异性抑制剂Zileuton是否是通过抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞氧化应激平衡失调，从而减轻心肌细胞病理性肥大，目前并不清楚，有待进一步研究。

在高血压环境下，循环增多的Ang Ⅱ是诱导心肌重构，促进心力衰竭发生的主要原因之一。本研究发现5-LOX能够抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大，其有可能成为抑制心肌重构、治疗心力衰竭的潜在靶点。