解毒消瘰方治疗非霍奇金淋巴瘤的疗效及对Th17/Treg细胞水平的影响

许晓娜，张宇，宋岩松，李航超，周郁鸿

非霍奇金淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，主要临床表现以无痛性淋巴结肿大为主，根据临床特点通常采取不同的治疗策略，主要是大剂量化疗联合自体造血干细胞移植，但仍有部分患者原发耐药或远期复发[1]。笔者采用解毒消瘰方联合化疗治疗非霍奇金淋巴瘤，取得了良好疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 纳入及排除标准 纳入标准：经病理活检证实为恶性淋巴瘤的初治患者，按2008年WHO淋巴瘤诊断标准进行分类，按AnnArbor标准分期，按IPI评分系统评价危险度[2]，性别不限，年龄18～75岁，患者预计生存期≥3个月。排除标准：（1）合并严重心血管、肝、肾、造血系统及免疫系统疾病、精神病患者；（2）有严重不可控制的感染、出血等症状的患者；（3）妊娠或哺乳期妇女，对本试验处方组成过敏者；（4）其他引起Th17/Treg细胞及相关细胞因子异常的疾病。

1.2 一般资料 选取2011年7月至2016年7月浙江中医药大学附属第一医院收治的患者60例，依据随机数字表分为治疗组及对照组，各30例。治疗组男15例，女15例；年龄19～73岁，中位年龄42岁；病理分型：滤泡型5例，弥漫大B型21例，套细胞型3例，伯基特型1例；Ann Arbor分期：I期5例，II期10例，III期8例，IV期7例；按IPI评分：低危组8例，中低危组13例，中高危组5例，高危组4例。对照组男18例，女12例；年龄25～75岁，中位年龄43岁；病理分型：滤泡型4例，弥漫大B型23例，套细胞型胞型2例，伯基特型1例。Ann Arbor分期：I期6例，II期11例，III期7例，IV期6例。按IPI评分：低危组5例，中低危组10例，中高危组8例，高危组7例。两组上述资料差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 根据2016NCCN指南选择不同病理类型非霍奇金淋巴瘤的化疗方案，连续进行4个疗程[2]。

1.3.2 治疗组 在对照组基础上联合解毒消瘰方，方含：蛇六谷、紫菀、半枝莲、藤梨根、桔梗、前胡、茯苓、白术、山海螺和蛇莓，每天1剂，早晚分服，3周为1个疗程，连续服用4个疗程。

1.3.3 支持治疗 治疗期间若中性粒细胞＜1.0×109/L，则给予粒细胞集落刺激因子（75g，惠尔血，日本麒麟鲲鹏）5～10g/kg皮下注射，每天1次，直至中性粒细胞＞1×109/L；治疗期间有粒缺和/或发热患者，预防性或根据药敏试验和经验性给予抗生素治疗；化疗期间常规给予止吐处理。

1.3.4 随症加减 兼往来寒热者，为肝胆有热：加柴胡10g、炒栀子6g、丹皮10g；兼胸胁满痛者，为气郁重：加青皮10g、厚朴6g；兼倦怠乏力，为正气亏虚：加炙黄芪15 g、生晒参6 g；兼潮热盗汗，为阴亏：加麦冬12 g，沙参12 g。

1.4 检测方法 （1）Treg细胞检测：取2支流式试管，做好标记，分别取100l肝素钠抗凝全血加入每支试管，然后依次加入20l同型对照（鼠IgG1/IgG2a）及抗CD4、CD25荧光单克隆抗体各10l，室温避光保存20 min。取出试管，每管加入10倍稀释了的1×红细胞裂解液2ml，涡旋混匀，室温避光10min。3000r/min离心5 min，弃上清。每管加入磷酸盐缓冲液（PBS）2ml，涡旋混匀，离心后弃去上清液，最后加入PBS液0.5ml混匀。4℃避光1h内上机检测。使用流式细胞分析仪进行检测，按规程操作。（2）Th17细胞检测：采用常规密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（PBMC），接种于培养板后加佛波酯（PMA）50g/L，离子霉素1mol/L，莫能霉素500g/L，在37℃、5%CO2温箱中孵育培养6h。收集细胞并调整细胞浓度为1×107/ml。取2支试管，做好标记，对应每管加细胞悬液100l，随后加入CD4-FITC10l，混匀后室温下避光反应20min。取出试管，PBS洗涤2次，加入固定液100l室温避光固定反应20min。离心弃上清液，PBS洗涤2次，加入破膜剂50l进行细胞打孔，室温避光固定反应20min。离心弃上清液后测定管加入IL-17 A-PE 10l，对照管加入IgG1-PE 10l，室温下避光反应20min，PBS洗涤2次后上流式细胞仪检测。（3）血清TGF-1、IL-17检测：取患者EDTA抗凝静脉血5 ml，3000 r/min离心30 min取上清。用间接酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒检测，操作流程以相应试剂盒说明书为准。

1.5 观察指标

1.5.1 近期疗效[3]完全缓解（CR），肿瘤消失并至少维持4周以上；部分缓解（PR），肿块缩小＞50%，并维持4周以上；稳定（SD），肿块缩小＜50%或增大＜25%，无新病灶出现；进展（PD），肿块增大＞25%或有新病灶出现；总缓解率=CR+PR。

1.5.2 Th17/Treg细胞及相关细胞因子比较 治疗组及对照组血清Treg、Th17细胞百分率，血清TGF-1、IL-17水平变化。

1.6 统计方法 应用SPSS16.0统计软件进行处理。计数资料比较采用2检验；计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异统计学意义。

2 结果

2.1 近期疗效 治疗组与对照组总缓解率分别为86.67%和83.33%，两组差异无统计学意义（2=0.131＞ 0.05），见表 1。

2.2 外周血Treg、Th17细胞百分率比较 治疗组外周血Treg细胞百分率低于对照组，Th17细胞百分率高于对照组（均＜0.05），见表2。治疗组血清TGF-1低于对照组，IL-17水平高于对照组（均＜ 0.05），见表 3。

3 讨论

研究表明，诱发非霍奇金淋巴瘤的独立危险因素是机体免疫缺陷及慢性炎性反应[4]。Th17和Treg细胞为初始CD+4T细胞分化的不同T细胞亚群，在机体免疫级联反应及炎性反应中起十分重要作用[5]。Th17细胞存在明显抗肿瘤作用[6]；而Treg细胞则以“主动”方式使机体免疫功能抑制[7]。全丽娜等[8]研究显示，B细胞非霍奇金淋巴瘤患者淋巴结组织内Th17细胞比例显著低于良性淋巴结。由此得出Treg细胞增加可能导致非霍奇金淋巴瘤患者机体免疫抑制，Th17细胞减少导致机体抗肿瘤机制减弱，从而易于肿瘤免疫逃逸。Th细胞分化的关键因子是TGF-1，其表达水平与Treg和Th17分化密切相关。Th17细胞分泌最具特征性细胞因子就是IL-17，它具有很强的促炎症作用，内源性IL-17还可能对肿瘤免疫方面发挥保护性作用。解毒消瘰方可调节机体免疫功能，进而提高Th17及IL-17水平，抑制Treg细胞及TGF-1水平。现代医学对该病的治疗措施主要包括放化疗。虽然大部分患者能缓解或者得到治愈；但对于部分淋巴瘤患者疗效仍不理想，出现复发耐药，病情发展可致死亡。

表1 两组近期疗效比较 例

表2 两组外周血Treg、Th17细胞百分率比较 %

表3 两组血清TGF-1、IL-17水平比较 pg/ml

非霍奇金淋巴瘤以无痛性淋巴结肿大为主，祖国医学并无非霍奇金淋巴瘤的记载，本病根据临床症状归属中医“瘰疠”、“石疽”、“瘤病”、“恶核”、“痰核”等范畴。中医在调节免疫的同时能增加化疗的效果并且减轻放化疗的毒副作用[9]。研古通今，结合临床经验认为：此病本虚标实，发病的根本是正气亏虚，正所谓“正气不足而后邪气踞之”。淋巴瘤发病的重要病因是“毒”，毒分内外，外感之“疫毒”、“温毒”等称之为外毒；阴阳平衡失司、五脏六腑功能紊乱而滋生出的“痰毒”、“瘀毒”、“火毒”等称之为内毒。根据其病因病机及临床表现自创了“解毒消瘰方”，方中蛇六谷化痰软坚、散结解毒，联合紫菀解“痰毒”；半枝莲辛苦寒，可清热解毒、消肿止痛，联合藤梨根解外邪毒；桔梗行气散瘀消积、散瘀解毒，联合前胡、蛇莓解“瘀毒”；山海螺益气养阴清内热解“火毒”，茯苓、白术匡扶正气，以扶正驱邪。全方解外感之邪毒，驱内在之痰瘀火毒，并扶住正气，使正气升邪毒乃去。有现代研究表明：紫菀、半枝莲、山海螺、前胡有抑瘤及抗肿瘤活性；蛇六谷对部分癌细胞敏感并对白血病细胞有抑制作用。

本研究提示，非霍奇金淋巴瘤使用解毒消瘰方后在总缓解率方面差异无统计学意义（P＞0.05），这可能由于观察时间相对较短，但中医发挥调节免疫的时间较长有关。此研究数据表示治疗组外周血Treg细胞百分率、血清TGF-1较对照组显著降低，Th17细胞百分及IL-17水平显著升高，表明非霍奇金淋巴瘤患者外周血Treg、Th17细胞比例及相关细胞因子表达水平异常，监测外周血Th17/Treg免疫平衡对NHL预后判定可能有重要意义。