胆碱能抗炎通路在病毒性心肌炎中的抗炎作用及其机制

陈学思，张丽梅，蔡敏敏

目前病毒性心肌炎的治疗仅限于以对症支持保守治疗，并无有效的针对病因治疗。虽大部分患者经适当治疗可完全恢复，但少部分患者转变为慢性心脏病，最终发展为非特异性扩张性心肌病[1-2]。最近研究发现，迷走神经及其递质乙酰胆碱（ACh）所构成的胆碱能抗炎通路（CAP）对炎症反应的调控具有重要的作用[3]。当机体受到损伤后，产生一系列炎症反应，中枢接受到机体受到这种刺激信号后，将信息投射到迷走神经核团，激活传出迷走神经纤维，使外周神经末梢释放ACH，与免疫细胞7-nACh受体结合，通过细胞内信号转导抑制促炎因子的释放，调控炎症反应[4-5]。这类炎症因子包括IL-1、TNF-、IL-6 及 IL-17[6-7]；而对 IL-10、TGF-等抗炎因子没有抑制作用[8]。然而CAP在病毒心肌炎中的作用尚不明确，本研究以CVB3感染BALB/C小鼠建立病毒性心肌炎模型，通过切断右侧迷走神经及烟碱等不同处理，观察心肌炎症浸润程度、炎症因子TNF-、INF、IL-1 、IL-6及相关通道蛋白STAT3和磷酸化STAT3表达变化，探讨CAP在病毒性心肌炎中的作用及其机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物选择和分组 健康雄性3周龄BALB/C小鼠200只，将BALB/C小鼠随机分为5组：（1）正常对照组（n=40）：腹腔予注射不含病毒的病毒培养液；（2）假手术组（n=40）：分离右侧迷走神经，腹腔予注射CVB3病毒；（3）烟碱组（n=40）：腹腔注射CVB3 病毒，后每天腹腔予注射烟碱；（4）迷走神经切断+烟碱组：分离并切除右侧迷走神经，腹腔予注射CVB3病毒，后每天腹腔予注射烟碱；（5）迷走神经切断组（n=40）：分离并切除右侧迷走神经，腹腔予注射CVB3病毒。

1.2 实验动物模型建立 将各实验处理组术前禁食8h，假手术组仅做迷走神经分离，迷走神经切断组及迷走神经切断+烟碱组迷走神经分离后予离断，待小鼠饲养至4周龄后，正常对照组腹腔注射不含病毒的Eagel’s病毒培养液0.1ml，其余4组予腹腔注射100TCID 50/0.1 ml的CVB3稀释液0.1 ml，接种当天记为第0天，从第1天开始烟碱组及迷走神经切断组+烟碱组予烟碱腹腔注射处理（1.2 mg/kg，每天分3次注射），直至第14天末。

1.3 生存率 注射病毒当天为第0天，5组实验组每组随机选取20只小鼠进行一般情况及生存情况观察研究，观察各实验组小鼠生存率。

1.4 标本留取 5组实验组在接种第0天，分别取2只小鼠处死（留取ELISA用），第7和14天，分别取8只小鼠处死后，分离心脏备用。

1.5 病理组织学检查 心脏组织固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后切片，再将切片进行HE染色后在电子显微镜下观察心肌细胞排列及形态、心肌组织损伤、坏死、纤维化及炎性细胞浸润程度，以心肌炎症浸润（I）及心肌坏死（N）进行评分。

1.6 Western blot检测 5组心脏组织分别加入组织裂解液，冰上匀浆，超声破碎，4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。取50g蛋白上样，电泳、蛋白转膜、抗体结合后，加ECL化学发光反应2min，采用AlhaimagerTM2200图像分析系统进行处理，AlphaEase40软件进行分析。

1.7 双抗体夹心ABC-ELISA法检测 取5组心脏组织研磨成10%匀浆液体，超声破碎细胞，4℃下3000 r/min

低速离心20min，取上清液，按说明书要求准备试剂后，对各组标本进行检测，按照标准品OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线，根据标本OD值在标准曲线图上查出相应待测炎症因子的含量。

1.8 统计方法 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验；计数资料以率表示，采用2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存率 正常对照组小鼠第14天无死亡，生存率为100%；假手术组小鼠第14天的生存率为45%（18/40），烟碱组小鼠生存率为80%（32/40），迷走神经切断+烟碱组小鼠生存率为70%（28/40），迷走神经切断组小鼠生存率35%（14/40）。以注射病毒记为第0天，其死亡高峰在第6天到第10天，且烟碱组生存率高于假手术组（2=10.5，P＜0.05），迷走神经切断+烟碱组生存率高于迷走神经切断组（2=9.8，P＜ 0.05）。

2.2 心肌组织病理变化 光镜下第7、14天，与假手术组相比，烟碱组及迷走神经切除+烟碱组的心肌组织炎症浸润及坏死减轻（t≥2.74，P＜0.05），而迷走神经切断组的心肌组织炎症浸润及坏死加重（t≥14.20，P＜0.05）；与迷走神经切断+烟碱组比较，迷走神经切除组心肌组织炎症浸润及坏死加重（t≥25.81，P＜0.05）。正常对照组心肌没有病理变化。见表1。

2.3 WB检测小鼠心肌信号蛋白表达水平

2.3.1 p-STAT3表达水平测定 在第7天，4组实验处理组小鼠心肌较正常对照组p-STAT3表达均升高（t≥10.95，均P＜0.05），且烟碱组小鼠心肌表达低于假手术组（t=21.71，P＜0.05），迷走切断+烟碱组及假手术组小鼠心肌表达均低于迷走切断组（t≥21.34，均P＜0.05）；在第14天，5组实验组小鼠心肌p-STAT3表达差异无统计学意义（t=1.64，P＞0.05）。见表2。

2.4 ELISA法检测心肌炎症因子 在第7天和第14天，与正常对照组比较，4组实验处理组TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎症因子均升高（t≥7.46，均P＜0.05）；与假手术组比较，烟碱组TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎症因子均下降（t≥10.55，均P＜0.05），而迷走切断组均升高（t≥10.69，均P＜0.05）；与迷走神经切断组比较，迷走神经切断+烟碱组TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎症因子均下降（t≥11.72，均P＜0.05）。见表4。

表1 各组小鼠第7、14天心肌组织病理评分比较 分

表2 各组小鼠第7天、14天心肌组织p-STAT3表达水平

表3 各组小鼠第7天、14天心肌组织 7nAChR表达水平

3 讨论

2000年，Borovikova等[7]通过人外周血巨噬细胞培养和动物模型实验研究发现，刺激外周迷走神经或其递质ACh能够抑制炎症性细胞释放炎症因子，减轻全身炎症反应，并将其命名为“CAP”。Wang等[9]进一步研究发现，对敲除7亚基基因小鼠刺激迷走神经，这种炎症抑制作用不会发生，确定了7烟碱型乙酰胆碱受体（7nAChR）在CAP中起关键作用。迷走神经不仅通过特有的中枢神经细胞7nAChR发挥抗炎作用，还用于巨噬细胞和CD4+T细胞等免疫细胞7nAChR[10-11]，信号递质ACh作用于人巨噬细胞减少了TNF-、IL-1 、IL-6、IL-18等促炎因子的产生[12]。然而研究证实，烟碱作为7nAChR特异性激动剂，与ACh相比能更有效的抑制巨噬细胞促炎因子的产生[13]。7nAChR介导的抗炎作用通过影响核转录因子NF-kB，同时JAK2/STAT3通路也参与了其中[14]；已经充分证实激活CAP可以减轻炎症反应，改善脓毒血症、内毒素血症、缺血再灌注损伤、失血性休克、胰腺炎、关节炎及其他炎症反应综合症的预后。也有研究证实了用烟碱激活 CAP可以减轻自身免疫性心肌炎的炎症，但是CAP在急性病毒性心肌炎中的作用研究尚不足。

表4 各组小鼠第7天、14天心肌组织炎症因子表达水平 pg/ml

本研究通过烟碱和切断右侧迷走神经等不同处理，观察病毒性心肌炎小鼠的生存率、心肌病理组织改变及心肌炎症因子表达变化等来探讨 CAP在病毒性心肌炎的作用。研究发现选择7nAChR特异性激动剂烟碱激活CAP，可减轻心肌炎小鼠心肌的病理损伤和炎症浸润，提高小鼠的生存率。进一步研究发现，与假手术组比较，第7和14天，小鼠心肌的TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎症因子表达均下调（均P＜0.05）。而切断右侧迷走神经拮抗CAP，加重了小鼠心肌病理损伤和炎症浸润，降低了小鼠的生存率；且在第7和14天，小鼠心肌的TNF-、INF、IL-1及IL-6炎症因子表达均较假手术组上调（均P＜0.05）。同时与迷走神经切除组比较，切断右侧迷走神经+烟碱其心肌病理组织损伤及炎症浸润减轻，TNF-、INF、IL-1及IL-6炎症因子的表达均下调（均P＜0.05）。因此笔者推测烟碱对病毒性心肌炎具有保护作用，其机制可能为烟碱作用与巨噬细胞7nAChR抑制TNF-、INF、IL-1及IL-6炎症因子表达；迷走神经参与了胆碱能抗炎的作用通路，切断右侧迷走神经 CAP的保护作用减弱。与正常对照组比较，假手术组、烟碱组、迷走神经切断＋烟碱组、迷走神经切断组STAT3的磷酸化水平升高（P＜0.05），提示JAK/STAT3通路STAT3磷酸化参与了炎症反应；在第7天，与假手术组比较，烟碱组STAT3磷酸化水平降低，而迷走神经切断组STAT3磷酸化水平增高。因此笔者推断烟碱激动7nAChR可能通过抑制JAK2/STAT3通路STAT3磷酸化参与炎症保护作用。