维生素B12对坛紫菜响应高温胁迫的影响

吴 磊，许 凯，徐 燕，纪德华，王文磊，陈昌生，谢潮添

(集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

0 引言

维生素是人类和其他生物所必须的微量营养成分之一，在维持生物的新陈代谢平衡中起着至关重要的作用，是生物多种代谢通路中关键酶的辅因子，维生素缺乏时会诱发一系列疾病的发生[1]。已有大量研究发现，B族维生素在藻类的生长发育中起着重要作用。许多藻类属B族维生素的营养缺陷型，其中22%的藻类属维生素B1(thiamine)的营养缺陷型，5%属维生素B7(biotin)的营养缺陷型，超过50%的藻类属维生素B12(cobalamin)的营养缺陷型[2]。由于藻类的维生素B12可能来源于其共生细菌，因此维生素B12在细菌与藻类相互作用的研究中越发受到重视[3]。

维生素B12在自然界中只能由细菌合成，真核生物不能合成B12，该合成过程需要20多种酶的参与。维生素B12是一种水溶性的咕啉类化合物，又称钴胺素，在生物体内有多种存在方式，具有重要辅酶功能。目前已知的维生素B12依赖型酶有20多种，如甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-coA mutase，MCM)、谷氨酸变位酶(glutamate mutase,GM)、甲硫氨酸合成酶(methionine synthase H,METH)，其中最为重要的就是甲硫氨酸合成酶[4]。甲硫氨酸是20种必须氨基酸之一，在生物的蛋白合成和甲基化中发挥关键作用。有研究[5]发现，甲硫氨酸能够显著提高莱茵衣藻在25 ℃下的耐热能力。需要指出的是，一些藻类还存在另一种B12非依赖型甲硫氨酸合成酶METE(B12-independent methionine synthase)，在没有B12条件下也可合成甲硫氨酸。

坛紫菜(Pyropiahaitanensis)是我国福建省、浙江省和广东省广泛栽培的大型经济海藻，具有极高的经济价值和基础研究价值[6]。近年来，坛紫菜筏式培养初期的高温回暖天气造成 “高温烂菜”频繁发生，给坛紫菜养殖户造成严重的经济损失[7]。谢波等[5]研究发现，某些B12产生菌在与莱茵衣藻共培养时，能够显著提高衣藻的耐热能力。紫菜等大型海藻中含有较高浓度的维生素B12，与动物肝脏中的浓度相当[8]。而坛紫菜作为真核藻类，自身并不能合成维生素B12，维生素B12的来源至今仍未确认。对坛紫菜的B12是否来源于其共生原核细菌还存有疑问，而维生素B12在坛紫菜应对高温胁迫时是否发挥作用仍不清楚。为了评估维生素B12在坛紫菜应对高温胁迫时的影响和可能发挥作用的机制，本研究考察了高温下维生素B12对坛紫菜的生理影响。

1 材料与方法

1.1 藻株来源和高温处理

实验选用的坛紫菜品系为Z-61，由集美大学选育。坛紫菜叶状体的最适培养温度为21℃，光照强度50 ～ 60 μmol/(m2·s)，光照周期12 L∶12 D，每2天更换一次培养基。培养基为营养盐加富的天然海水，营养盐浓度参考Provasoli’s enrichment solution (PES)[9]。

取长度为10～15 cm的健康藻体，分别在21 ℃和31 ℃下培养5 d。为了研究维生素B12和甲硫氨酸对高温胁迫的响应，往培养基中分别添加维生素B12至终质量浓度为10 μg/L和100 μg/L，添加甲硫氨酸至终浓度为1 mmol/L和10 mmol/L。每个处理设置3个生物学重复。

1.2 藻体长度和鲜重

分别在高温处理的第0天及第5天进行坛紫菜Z-61叶状体长度测量。用纱布吸干藻体表面水分，测量藻体鲜重。藻体长度和鲜重日生长速率的计算公式与数据处理方式同参考文献[10]。

1.3 形态观察

为评估高温胁迫以及维生素B12和甲硫氨酸的作用，对坛紫菜Z-61叶状体进行形态观察。将叶状体平铺在标本纸上，对Z-61叶状体进行拍照。

1.4 最大量子产量

用DIVING-PAM仪(德国，Walz)测量坛紫菜的光化学效率及快速光曲线。叶片经过15 min暗处理后，用微弱的检测光(0.15 μmol/(m2·s))测量藻体的最小荧光值F0，此时光系统Ⅱ的所有反应中心均处于开放状态。然后，给一个0.8 s的饱和脉冲，获得最大荧光值Fm，此时光系统II的所有反应中心均处于关闭状态。最大量子产量(Fv/Fm)的计算公式是：(Fm-F0)/Fm。使用8个不同强度(166，607，1267，1795，2724，3395，4934，6578 μmol/(m2·s))，持续时间为10 s的光化光来测定快速光响应曲线。相对电子传递速率(rETR)计算公式为rETR = yield×0.84×0.5×PAR,其中：yield为光系统Ⅱ的有效光化学效率，0.84代表大约有84%的入射光被植物/藻体所吸收，0.5代表约50%被吸收的光能分配到光系统Ⅱ，PAR则为光化光的强度。快速光响应曲线用公式(Jasby and Platt,1976)ETR=ETRmax×tanh (α×PAR/Pmax)拟合，其中：ETRmax为ETR的最大值，PAR则为光化光的强度，α为光限制部分的初始斜率。

1.5 数据分析

采用单因素方差(one-way ANOVA，LSD)分析不同pH处理的差异，P>0.05代表差异不显著，具统计意义；P<0.05代表差异显著，具统计意义。

2 结果

2.1 藻体长度和鲜重

21℃常温下，坛紫菜叶状体长度日增加速率ΔL达到(2.77±0.326)cm/d，鲜重平均日增长速率ΔW达到(0.045±0.0052)g/d(见表 1)。而31 ℃高温胁迫下，叶状体几乎停止生长，其长度和鲜重日增加速率分别约为常温的7%和9%。维生素B12和甲硫氨酸在高温胁迫下并未促进坛紫菜的生长。

表 1 坛紫菜叶状体高温胁迫下长度和鲜重平均日增长速率Tab.1 The length-growth rates and weight-growth rates of P.haitanensis under high temperature stress

2.2 形态学观察

在高温处理第5天时，31 ℃高温空白对照组已明显发生大面积溃烂(见图1)，而在外源添加维生素B12和甲硫氨酸下的坛紫菜叶状体并未出现明显溃烂，但是在维生素B12100 μg/L处理组和甲硫氨酸1 mmol/L处理组已经出现点状溃烂(见图1红色箭头标注处)。说明维生素B12和甲硫氨酸能够显著提高坛紫菜叶状体的耐热性。

2.3 光合参数

通过快速光曲线的测定发现(见图2)，在高温胁迫处理下，各组Fv/Fm均呈下降趋势；维生素B12处理0～2 d时与对照组相比Fv/Fm并未有明显变化，在处理3 d时，处理组相较于对照组Fv/Fm显著下降，10 μg/L组与100 μg/L组Fv/Fm在整个高温胁迫处理过程中都无显著差异；甲硫氨酸处理组与维生素B12处理组Fv/Fm变化趋势整体较为相似，在高温处理0～2 d时与对照组相比Fv/Fm并未有显著差异，处理3 d时1 mmol/L组与10 mmol/L 组Fv/Fm均显著高于对照组，但处理4 d时10 mmol/L组Fv/Fm却显著低于对照组，处理5 d时1 mmol/L 组与10 mmol/L组Fv/Fm却显著低于对照组。提示维生素B12和甲硫氨酸在提高坛紫菜耐高温能力中都发挥了重要作用，但作用方式可能存在不同。

通过快速光曲线的测定发现(见图3)，在第0天，维生素B12组、甲硫氨酸组和对照组的曲线几乎重合，对rETRmax 、Ik和α的影响较小，变化幅度<30%。而高温胁迫处理3 d后，维生素B12显著增强了rETRmax，10 μg/L组上升约60%，100 μg/L组上升约30%。而甲硫氨酸显著降低了rETRmax 、Ik和α，rETRmax降幅在80左右，Ik和α下降约40%。高温处理5 d后，所有藻体的rETRmax 、Ik和α都大幅度降低。(见表2)。

表2 快速光曲线的3个拟合参数Tab.2 Three parameters fitted from the rapid light curves

3 讨论

高温是坛紫菜养殖过程中最常见的胁迫之一，高温胁迫会对坛紫菜的各项生理指标造成影响。在持续的高温胁迫下，坛紫菜基本停止生长,长度日平均生长速率在0.1～0.2 cm/d左右，部分溃烂藻体鲜重甚至呈负增长(见表 1)。李兵等[11]研究表明，坛紫菜在高温30 ℃静水胁迫下的品质会显著降低，生长缓慢，光合色素含量、粗蛋白含量、总氨基酸含量会显著降低。坛紫菜在高温胁迫下生长受到抑制，随着高温胁迫时间的延长，藻体会发生溃烂。但是在外源添加维生素B12和甲硫氨酸后，藻体并未发生明显溃烂(见图1)，说明维生素B12和甲硫氨酸能够提高坛紫菜的耐热性。谢波等[5]研究发现，在高温胁迫下莱茵衣藻METE基因的表达量会显著下调，METH基因部分表达；在添加维生素B12后，只有METH基因能够发挥作用继续合成甲硫氨酸，从而提高衣藻的耐热能力。

光合作用是植物最重要的生理反应之一，也是对高温响应最为敏感的生理反应。高温会对坛紫菜光反应中心造成影响，导致光合色素的含量下降。光合参数能够直接反应植物的光合作用。坛紫菜叶状体在高温胁迫下各项光合参数都受到影响(见图 2)。所有藻体Fv/Fm在高温处理前2 d时未见明显下降，2 d后开始下降(见图 2)。Xu等[12]研究发现，坛紫菜Z-61在29 ℃高温下培养2 d未见显著下降，这与本研究结果保持一致。本研究在添加了维生素B12和甲硫氨酸处理2 d后，rETRmax 、Ik和α下降速率会减慢(见图3)，这提示添加了维生素B12和甲硫氨酸的藻体光合保护能力更强；随着处理时间的延长(3～5 d)，维生素B12能够继续保护坛紫菜的光合系统，维生素B12处理组的ETR和Fv/Fm的一致性很高，但是添加了甲硫氨酸的藻体在胁迫后期光合参数下降较快，高浓度甲硫氨酸处理组降低了ETR和Fv/Fm，而低浓度组仅降低了Fv/Fm，且对ETRmax没有显著影响。

外源添加维生素B12，一方面可以促进坛紫菜合成甲硫氨酸。甲硫氨酸可参与有关抗逆蛋白的合成或者作为甲基供体参与甲基化来协助坛紫菜应对胁迫。Giovanelli等[13]研究发现植物体内的甲硫氨酸有两种去向，大约20%的甲硫氨酸将用于合成蛋白质参与各种生理活动，剩下80%的甲硫氨酸用于合成生物体内主要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸，用于DNA、RNA和蛋白质等分子的甲基化反应。甲基化在植物应对非生物胁迫时发挥着重要作用。另一方面，维生素B12也可以调节某些相关基因的表达来共同应对胁迫。在只添加甲硫氨酸的条件下，通过相关蛋白的合成和甲基化调控可以维持坛紫菜的存活，但是对坛紫菜PSⅡ反应中心的保护不及外源添加维生素B12，维生素B12可能激活了某些抗逆相关基因的表达，保证了光系统的正常运行。在原核生物中，维生素B12可以通过控制核糖开关(Riboswitch)对目标基因的表达进行调节[14]，但是，藻类中目前仍未发现与维生素B12相关的核糖开关。综上所述，维生素B12和甲硫氨酸在坛紫菜应对高温胁迫时发挥了重要作用，但作用机理还需要进一步研究。