豆粕酶解及其品质改善研究

陈 思，张雪芳，肖 琼,2,3，陈艳红,2,3，倪 辉,2,4，肖安风,2,3,4,

(1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省海洋功能食品工程技术研究中心，福建 厦门 361021；3.厦门市海洋功能食品重点实验室，福建 厦门 361021；4.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021)

0 引言

豆粕是大豆提取豆油后的残渣再经过适度加工得到的副产品[1]，是目前饲料行业中使用范围较广的一种优质植物性蛋白饲料源[2]。豆粕蛋白质质量分数在40%以上，但是分子质量大、结构紧密，导致消化利用率不高[3]。在适宜的条件下添加蛋白酶制剂，将大分子蛋白质降解成小分子蛋白质、小肽和氨基酸，从而使蛋白质分子质量降低[4]，具有低抗原性，更易于吸收，可大大提高蛋白质的利用率[5]。李树品等[6]选用中性蛋白酶酶解豆粕，蛋白质消化率可达70%以上，并适当添加纤维素酶和α-淀粉酶后，对提高蛋白质消化率有利。李磊等[7]对大豆饼粕进行中性蛋白酶和酸性蛋白酶双酶联合水解处理，探索出了最适工艺条件：先加中性蛋白酶，温度为40 ℃，pH=8.0，料水比(m/V)为1∶9，加酶量为7%，水解6 h，后加酸性蛋白酶，温度为45 ℃，pH=3.0，加酶量为3%，水解8 h，蛋白质水解度可达42.2%。

蛋白酶系对非淀粉多糖如纤维素、棉籽糖、水苏糖等不起作用，而此成分在豆粕中占较大比例(约20%)，在动物消化道内结合大量水，阻碍营养物质的消化利用[8]。所以，必须添加适宜的酶制剂降解这些抗营养因子，降低对动物消化系统、免疫系统的伤害[9]。何中山[10]研究得出：应用中性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和β-甘露聚糖酶酶解豆粕，酶解后产品中还原糖为8.2%，蛋白质水解度为4.5%。为了解决豆粕中所含的蛋白质分子质量较大、动物对其利用率相对较低、一些抗营养因子限制了豆粕的使用[11]等问题，本文采用单因素试验设计，探究蛋白酶和非淀粉多糖(non-starch polysaccharide,NSP)酶复合添加、反应时间对豆粕中蛋白质水解度、还原糖释放量、总糖含量的影响，对酶解豆粕品质进行评价，从而提高其利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶均购自和氏璧生物技术有限公司；豆粕购自厦门夏商淘化大同食品有限公司，质量符合GB/T 19541—2004规定：颗粒40目，色泽呈浅黄色，具有烤大豆香味，没有酸败、霉变、焦化等异味，均匀流动性好，呈不规则碎片状，不含过量杂质，粗蛋白质量分数为46.2%。

甲醛、浓硫酸、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷、葡萄糖、酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；苯酚、3，5-二硝基水杨酸、邻苯二甲酸氢钾均为分析纯，购自西陇化工股份有限公司。

1.2 豆粕酶解工艺

1.2.1 酶添加量对豆粕品质的影响

将20 g豆粕装于250 mL三角瓶中密封，121 ℃、高压灭菌20 min，冷却后加入中性蛋白酶，设定料水比(m/V)为1∶1，温度为45 ℃，酶解时间为48 h，研究不同加酶量对豆粕品质的影响；添加30 U/g中性蛋白酶和不同用量的酸性蛋白酶，研究其对豆粕品质的影响；添加30 U/g中性蛋白酶、50 U/g酸性蛋白酶和不同用量的纤维素酶，研究其对豆粕品质的影响；添加30 U/g中性蛋白酶、50 U/g酸性蛋白酶、50 U/g纤维素酶和不同用量的木聚糖酶，研究其对豆粕品质的影响。

1.2.2 酶解时间对豆粕品质的影响

添加30 U/g的中性蛋白酶到装有20 g豆粕的250 mL三角瓶中，料水比(m/V)为1∶1，搅拌均匀，置于45 ℃恒温摇床中，研究酶解时间(12,24，36，48，60，72 h)对豆粕的影响；固定以上酶解条件，添加30 U/g的中性蛋白酶和50 U/g的酸性蛋白酶，研究2种酶共同作用时不同酶解时间对豆粕品质的影响；添加30 U/g的中性蛋白酶、50 U/g的酸性蛋白酶和50 U/g的纤维素酶，研究3种酶共同作用时不同酶解时间对豆粕品质的影响；添加30 U/g的中性蛋白酶、50 U/g的酸性蛋白酶、50 U/g的纤维素酶和50 U/g的木聚糖酶，研究4种酶共同作用时不同酶解时间对豆粕品质的影响。

1.3 主要检测指标和分析方法

1.3.1 感官评价

参照国标GB 21172—2007[12]和农业行业标准NYT 2218—2012[13]的规定以及陈萱等[14]使用的感官分析方法并有所改进。设定在光线正常及无异味的环境下，将适量各种酶解豆粕样品倒入干净的玻璃容器中，通过目测、鼻嗅、手感分别评定样品的颜色、气味和质地，具体标准见表1。

表1 酶解豆粕感官评价标准表Tab.1 Sensory evaluation of soybean meal enzymolysis

1.3.2 pH值的测定

取各个酶解豆粕样品l.0 g，加蒸馏水50 mL，于摇床上180 r/min振荡20 min，过滤，测上清液pH值。

1.3.3 蛋白质水解度的测定

蛋白质水解度测定采用甲醛滴定法[15-16]：称取5 g样品，加入50 mL煮沸冷却的蒸馏水，磁力搅拌30 min，调整pH值为8.2，量取20 mL质量分数37%中性甲醛溶液加入到水解液中，持续搅拌，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，当pH=9.2时记录消耗的碱液体积。蛋白质水解度(degree of hydrolysis,DH)计算公式为：DH/%=(c×V×1.400 8)/(m×7.8)×100，式中：DH为蛋白质水解度(%)；c为NaOH溶液浓度(mol/L)；V为NaOH溶液消耗体积(mL)；1.400 8为1 mL 0.1 mol/L NaOH相当的氮量；m为样品的质量(g)；7.8为每克原料蛋白质肽键的物质的量(mmol)。

1.3.4 还原糖含量的测定

还原糖含量测定采用DNS法[17]：称取0.1 g样品，加入30 mL蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌溶解20 min后3 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL加DNS溶液混匀后于沸水浴显色5 min，冷却后加蒸馏水补足体积至10 mL，再次混合均匀后于波长540 nm处测吸光度值。每组做3个平行，根据葡萄糖标准曲线计算得到样品中还原糖含量。

总糖含量采用硫酸-苯酚法测定[18]：取1 g样品加入15 mL纤维素酶液(pH=5.5)，60 ℃下振荡水浴1 h，离心、过滤，取上清液适当稀释后，取2 mL稀释液与1 mL质量分数6%苯酚混匀，快速加入浓硫酸5 mL，混匀，室温条件下静置30 min，每组做3个平行，于波长490 nm处测吸光度值。根据葡萄糖标准曲线计算得到样品中总糖含量。总糖得率/%=(X×D/m)×100，式中：X为样品溶液的葡萄糖质量(μg)；D为样品溶液的稀释倍数；m为样品的质量(μg)。水解度/%=还原糖释放量/总糖含量×100。

2 结果与分析

2.1 酶解工艺对豆粕品质的影响

2.1.1 中性蛋白酶添加量对豆粕品质的影响

参考李树品等[6]用中性蛋白酶水解豆粕，在料水比为1∶10、pH=7.5、温度为40 ℃条件下水解64～72 h，得到的蛋白质消化率≥70%。采用中性蛋白酶水解豆粕，在料水比为1∶1、温度为45 ℃条件下水解48 h，考察其添加量对豆粕品质的影响。结果(见图1)表明，加酶量达到30 U/g后，感官品质不再变化；加酶量对pH值无明显影响；30 U/g时蛋白质水解度最高可达20.7%；总糖质量分数随着酶量增加而上升，70 U/g时最高为8.5%，还原糖的释放量和水解度变化不明显,说明中性蛋白酶对还原糖分解作用不大。综上，将中性蛋白酶的添加量确定为30 U/g。

2.1.2 酸性蛋白酶添加量对豆粕品质的影响

参考李磊等[7]在pH=8.0、料液比为1∶9、温度为40 ℃的条件下加入质量分数7%中性蛋白酶作用6 h，后调pH=3.0，45 ℃下加入质量分数5%酸性蛋白酶作用8 h，蛋白质水解度达到了44.2%，以料水比为1∶1，温度为45 ℃，酶解时间为48 h，添加30 U/g中性蛋白酶和不同用量的酸性蛋白酶，确定适宜添加量。由图2可见，加入酸性蛋白酶后，豆粕气味由单一的酱香味转变为浓厚的醇香味；pH值都接近于8.4，与单酶水解时比较，pH值上升，但是酸性蛋白酶适宜的pH值范围为2.5～6.0，可能发挥不出酸性蛋白酶的优势；酸性蛋白酶添加量30 U/g以上，蛋白质水解度20%左右，与单酶蛋白质水解度相比没有提升；总糖质量分数明显提高， 50 U/g时为最小值也达到了18.2%；但还原糖质量分数变化幅度较小，仅提高了0.3%，说明非淀粉多糖需要加入特定的酶(NSP酶)才能水解。综上，确定酸性蛋白酶的添加量为50 U/g。

2.1.3 纤维素酶添加量对豆粕品质的影响

考虑到蛋白酶系对非淀粉多糖不起作用，而此成分又在豆粕中占较大比例(约20%)，在动物消化道内可结合大量水，阻碍营养物质的消化利用，所以必须添加适宜的酶制剂分解[8]。其中豆皮主要是粗纤维，细胞壁中也含有纤维素，故NSP酶可选纤维素酶。高红岩等[19]利用纤维素酶制剂降解豆粕中的纤维素，以提高豆粕蛋白质水溶出率，加入蛋白酶和纤维素酶后蛋白质水溶出率达到76.2%，比仅以蛋白酶水解豆粕的蛋白质水溶出率(67.8%)高，说明通过降解纤维素可提高豆粕蛋白质的溶出率。

添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶后考察纤维素酶添加量对豆粕品质的影响，结果见图3。

图3表明，主要感官指标维持在稳定状态，关键指标蛋白质水解度在50 U/g时达到最大值22.3%，还原糖释放量明显增加，最大值达到了2.3%，总糖质量分数仍保持在20%以上，还原糖水解度整体提高到了10%以上，说明纤维素酶对非淀粉多糖分解有一定作用。综上，选择50 U/g的纤维素酶做后续实验。

2.1.4 木聚糖酶添加量对豆粕品质的影响

非淀粉多糖的化学结构非常复杂，一种酶只能特异降解一种糖苷键[20]，因此考虑再加入木聚糖酶形成复合酶共同作用降解豆粕中NSP。图4表明：主要感官指标维持在稳定状态，但是蛋白质水解度变化不大，添加复合NSP酶没有起到强化蛋白质酶解效果。究其原因可能有3点：一是蛋白酶的水解环境导致NSP酶失活，在添加有蛋白酶的前提下，NSP酶同样作为蛋白质极有可能作为底物而被降解；二是酶来源不同，其最佳酶活性的温度和pH值等条件也不同，因而在同一水解条件下应用的效果就不同，且一般NSP酶比较适合酸性环境，因此，在偏碱性环境下其酶活就可能受到抑制，达不到酶解的合适条件；三是随着蛋白酶水平的增加，可作用的底物浓度降低，水解度的差异变小。总糖质量分数明显下降，最小值为11.7%，降低了近10%，还原糖质量分数与添加三酶时没有太大区别，可能是总糖被分解时还产生了其他非还原糖类物质。

2.2 酶制剂动态酶解过程的优化

2.2.1 酶解时间对豆粕感官的影响

由图5可以看出，酶解时间对豆粕的颜色、气味和质地等感官指标均有影响。在36 h之内，时间越长指标变化越明显，48 h后变化趋势趋于平缓，说明，在48 h各酶制剂组合酶解豆粕可达到较佳的效果。由图5还可见，同一时间段内，酶制剂种类的增加并没有达到感官优化的效果。在酶解时间较长后(48～72 h)豆粕为褐色，具有浓郁的香味和粘手的触感。

2.2.2 酶解时间对豆粕pH值的影响

由图6可知，在短时间内(12 h)酶解豆粕pH值接近于中性或偏酸性，倾向于原料pH值，这可能是该时间段为初期，酶与物料的接触不够充分，酶解效率低导致pH值的变化较小。随着时间的延长，pH值随之增大，在后期稳定在7.8～8.2。pH值偏中性，说明酶解作用增强且中性蛋白酶的影响最大。

2.2.3 酶解时间对豆粕蛋白质水解度的影响

蛋白质通过水解作用水解为二肽或三肽的产物，具有特殊的生理活性[21-23]，在动物体内要比自由氨基酸和没有水解的蛋白质更易于吸收[24]，所以蛋白质水解度是衡量蛋白质酶解效率的重要指标。由图7可知，不同组合的酶制剂在一定的水解时间内，均可以提高豆粕的蛋白质水解度，且随着反应时间的增加而提高。当达到60 h后，水解度变化趋于平缓。仅添加中性蛋白酶，36 h后蛋白质水解增长幅度减小，72 h测得最大水解度值为22.5%；加入酸性蛋白酶后，水解度在实验前期得到很大提升，48～72 h后水解程度趋于稳定且达到最大值23.8%，优于中性蛋白酶单酶水解度，说明两种酶复合作用可以提高蛋白的水解度；但同时加入NSP酶如纤维素酶或和木聚糖酶后，酶解样品与中性蛋白酶单独酶解的对照样品相比，水解度并没有得到提高，说明NSP酶并没有起到强化酶解蛋白质的作用。考虑到蛋白质的水解效果和时间效益，将酶解时间均定为48 h。

2.2.4 酶解时间对豆粕糖质量分数的影响

酶制剂酶解时间对豆粕还原糖、总糖质量分数、还原糖水解度的影响见图8。由图8可见，同一时间段还原糖水解度大小并未同外源酶种类的增加而呈现规律性的变化。添加中性蛋白酶、酸性蛋白酶所得还原糖水解度较低，但与单酶相比较，其总糖含量提升。添加三酶或四酶时的总糖和还原糖含量均提高。

综上，考虑酶解时间对豆粕各方面品质的影响，将酶解时间确定为48 h。

3 结论

本文采用单因素试验设计，研究酶用量及酶解时间对豆粕品质的影响，表明：中性蛋白酶酶解豆粕最佳用量及时间为30 U/g，48 h，该条件下获得蛋白质水解度为20.1%，还原糖释放量和总糖质量分数分别为1.18%，7.44%；双酶联合酶解豆粕优化酸性蛋白酶的添加量及酶解时间为50 U/g，48 h，测得豆粕蛋白质水解度、还原糖释放量和总糖质量分数分别为22.7%，1.23%，18.01%；三酶复合酶解时优化纤维素酶的加酶量及酶解时间为50 U/g，48 h，此时豆粕蛋白质水解度、总糖质量分数分别为18.3%，18.22%，还原糖释放量增加，提高了1%；多酶复合酶解木聚糖酶的适宜添加量及反应时间分别是50 U/g，48 h，蛋白质水解度、还原糖释放量和总糖质量分数分别为18.3%，1.91%，15.41%。说明，在自然pH值的条件下进行酶解，仅添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶复合酶解的蛋白水解度比较好，同时添加NPS酶对水解度影响不大，但是还原糖释放量比较高。