实验室小规模微生物琼脂平板发酵培养操作模式优化

王静，孙桂芝，江冰娅，李书芬，黎林丽，胡笑文，胡晓敏，左利杰，武临专



实验室小规模微生物琼脂平板发酵培养操作模式优化

王静，孙桂芝，江冰娅，李书芬，黎林丽，胡笑文，胡晓敏，左利杰，武临专

100050 北京，中国医学科学院医药生物技术研究所卫健委抗生素生物工程重点实验室

微生物发酵主要分为固态和液态两种模式，在实验室和工业生产中，固态和液态发酵培养均具有广泛的应用。在科研单位微生物实验室中，琼脂平板（或培养皿）和摇瓶分别是微生物固态与液态发酵培养的常用器皿；琼脂培养基平板不仅可以用于制备液态发酵的起始种子或孢子悬液，更可以为科研单位微生物实验室提供一定数量的发酵培养物，用于分离纯化或积累目标样品化合物。

近年来，本文作者及所在课题组对微生物（主要是放线菌）进行琼脂平板发酵培养，然后收集发酵培养物，从中发现具有新结构或新活性的次级代谢产物，获得了较好研究结果或积极回报[1-9]。

在实际工作中，实验室目前使用的微生物琼脂平板发酵培养操作方法，从配制发酵培养基、倒琼脂平板，再到接种微生物种子（孢子）悬液，仍然是传统的手工操作模式，具有劳动强度高、工作效率低、琼脂平板不够标准化等缺点。因此，围绕这些问题，我们在实践中进行了如下三方面改进。

⑴培养基配制：微生物发酵培养基中一般含有黄豆饼粉、棉籽饼粉等难溶性成分，也经常包含淀粉等需要糊化后使用的成分。在将各种培养基成分称量、混合并加水悬浮或部分溶解后，首先需要使用电炉或电磁炉进行加热预处理，使其膨胀、溶解或糊化，然后才能进行分装和灭菌处理。特别是在加热预处理过程中，需人工对培养基进行搅拌和看护。我们使用豆浆机（图 1），采用其预设程序，实现了对加热和搅拌的自动化和智能化合并处理，不再需要人工搅拌

B

⑵倒平板：传统方法是手工倒琼脂平板，工作强度大，倒出的琼脂平板也不标准化（每个平板的培养基装量不完全一致），有可能导致微生物发酵培养周期的不同步。改进的方法是使用分配型蠕动泵（图 1），即将硅胶管的两端连接上止回阀和不锈钢吸管，然后灭菌；将硅胶管安装到蠕动泵的泵头，不锈钢吸管一端插到灭菌后的培养基中，在蠕动泵上设定每个平板的培养基分装体积，操作（可以安装脚踏板控制）蠕动泵实现半自动化的倒琼脂平板操作，并且每个琼脂平板的装量完全一致。此外，改变蠕动泵的液晶控制面板参数可以方便地对培养基装量进行调整。如果需要倒多种不同发酵培养基配方的琼脂平板，那么用无菌水在线蠕动清洗残留有之前培养基（即使培养基琼脂凝固了也不要紧）的硅胶管后，就可以更换发酵培养基继续倒下一批琼脂平板了。

⑶接种：传统方法是首先使用滴管将种子或孢子悬液分配到每个平板中，然后采用玻璃三角棒将种子或孢子悬液均匀涂布于平板培养基表面，属于两步人工操作，特别是使用玻璃三角棒把种子或孢子悬液涂布均匀，费时费力。改进方法是使用硅胶刷（图 1），与玻璃三角棒相比，硅胶刷的毛软而富有弹性，可反复高压灭菌，非常结实耐用，并且每次使用后的清洗也非常方便。操作过程中，只需将硅胶刷沾一下种子或孢子悬液，每次吸附0.5 ~ 1.5 ml 悬液（与硅胶刷的大小和毛数有关），然后直接涂布发酵培养平板，硅胶刷在琼脂培养基平板的表面行走流畅，使得分配涂布种子悬液更加快速而均匀。与使用滴管和玻璃三角棒相比，由于硅胶刷将传统的两步操作合并为一步，因而大大提高了工作效率，例如原来一般需要 2 h 才能完成的接种工作量，现在可以 1 h 内完成，减少了工作时间，降低了劳动强度。

虽然国内外已经有商业化的全自动培养基分装设备用于液体培养基分装和熔融的琼脂培养基分装（需要有保温装置），但是由于要求使用标准化的平板（培养皿），特别是每次使用的前期准备工作和使用后的收拾清理任务比较繁杂，加之科研单位实验室的微生物发酵培养琼脂平板的规格多，培养基组成配方的变化也多，尤其是需要的琼脂平板数量一般不太大，所以全自动培养基分装设备在科研单位微生物实验室并没有得到广泛应用。

本文对小规模微生物琼脂培养基平板的发酵培养操作模式进行优化，非常适合科研单位微生物实验室，特别是结合使用无菌化的一次性塑料平板（培养皿），可以高效地完成实验室规模（例如 5 ~ 25 L）的微生物琼脂培养基平板的发酵培养，从而为后续的目标化合物分离纯化以及积累一定量的研究测试样品提供发酵培养物。

[1] Jiang B, Zhao W, Li S, et al. Cytotoxic dibohemamines D-F from a Streptomyces species. J Nat Prod, 2017, 80(10):2825-2829.

[2] Zuo L, Jiang BY, Jiang Z, et al. Hangtaimycin, a peptide secondary metabolite discovered from Streptomyces spectabilis CPCC 200148 by chemical screening. J Antibiot (Tokyo), 2016, 69(11):835-838.

[3] Zhao W, Jiang B, Wu L, et al. Two herbimycin analogs, 4,5-dihydro- 4(S)-hydroxyherbimycin B and 15-hydroxyherbimycin B, from Streptomyces sp. CPCC 200291. J Antibiot (Tokyo), 2015, 68(7):476- 480.

[4] Jiang B, Li S, Zhao W, et al. 6-deoxy-13-hydroxy-8,11-dione- dihydrogranaticin B, an intermediate in granaticin biosynthesis, from Streptomyces sp. CPCC 200532. J Nat Prod, 2014, 77(9):2130-2133.

[5] Li T, Ni S, Jia C, et al. Identification of 4,5-dihydro-4- hydroxygeldanamycins as shunt products of geldanamycin biosynthesis. J Nat Prod, 2012, 75(8):1480-1484.

[6] Jiang BY, Zhao W, Li SF, et al. Isolation and identification of bohemamines as secondary metabolites from Streptomyces sp. CPCC 200497. Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):394-399. (in Chinese)

江冰娅, 赵薇, 李书芬, 等. 链霉菌Streptomyces sp. CPCC 200497次级代谢产物bohemamines的分离和鉴定. 中国医药生物技术, 2016, 11(5):394-399.

[7] Zuo LJ, Zhao W, Jiang ZB, et al. Identification of 3-demethylchuangxinmycin from Actinoplanes tsinanensis CPCC 200056. Acta Pharm Sinica, 2016, 51(1):105-109. (in Chinese)

左利杰, 赵薇, 江志波, 等. 济南游动放线菌CPCC 200056产生的3-去甲创新霉素发现与鉴定. 药学学报, 2016, 51(1):105-109.

[8] Zhao W, Jiang BY, Zuo LJ, et al. Identification of quinomycins as principal secondary metabolites from Streptomyces sp. CPCC 200497. Chin Med Biotechnol, 2016, 11(1):21-26. (in Chinese)

赵薇, 江冰娅, 左利杰, 等. 链霉菌Streptomyces sp. CPCC 200497产生的主要次级代谢产物——醌霉素的鉴定. 中国医药生物技术杂志, 2016, 11(1):21-26.

[9] Nan YN, Bai XG, Sun GZ, et al. Solid-state fermentation of Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 for ansamitocins and preparation of ansamitocin P-0. Chin J Antibiot, 2015, 40(4):241-244. (in Chinese)

南艳妮, 白晓光, 孙桂芝, 等. 珍贵束丝放线菌固体发酵生产安丝菌素及安丝菌素P-0制备. 中国抗生素杂志, 2015, 40(4):241-244.

国家自然科学基金（81573328）

武临专，Email：wulinzhuan@imb.pumc.edu.cn

2018-07-08

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.018