XIAP、cyclin D1及survivin在宫颈癌组织中的表达及意义

贾利刚，褚兆苹，田菲，韩华，代聪伟，王蓓，张媛

河北省人民医院妇科，石家庄 050051

宫颈癌是女性常见的一种恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌。近些年来虽然宫颈癌筛查技术不断普及推广，但其发病率仍呈上升趋势并趋于年轻化[1-3]。目前宫颈癌发生的分子机制尚不明确，但肿瘤细胞的恶性增殖、细胞凋亡受限制、细胞周期紊乱是宫颈癌等恶性肿瘤发生发展的重要原因之一[4]。X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是Rajcan-Separovic等[5]发现的一种凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），能够选择性地通过调控天冬氨酸蛋白水解酶的活性，进而抑制细胞凋亡。研究发现，IAP可以参与多种肿瘤的发生发展[6]。细胞周期蛋白D1（cyclin D1）是与G1期密切相关的细胞周期蛋白，通过正向调控G1期向S期转换，促使细胞恶性增殖，因此与肿瘤的发生发展密切相关[7]。存活蛋白（survivin）是目前发现的IAP家族中抗凋亡活性最强的抑制因子之一，在众多肿瘤组织中高表达，是众多学者认为的最有希望成为肿瘤治疗的靶点之一[8-9]。本研究采用免疫组织化学法检测XIAP、cyclin D1及survivin在宫颈癌组织中的表达，并分析其与宫颈癌患者临床特征的关系，旨在为宫颈癌的治疗提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1月至2018年1月于河北省人民医院行手术切除并经病理确诊的68例宫颈癌患者的宫颈癌组织标本。68例患者中，≤50岁36例，＞50岁32例；年龄43～70岁，平均（55.8±3.5）岁；分化程度：高分化22例，中分化15例，低分化31例；肿瘤直径≥4 cm 28例，＜4 cm 40例；国际妇产科联盟分期：IA期37例，IB～ⅡA期31例；有淋巴结转移28例，无淋巴结转移40例。另选取68例因子宫肌瘤而行子宫切除术患者的正常宫颈组织作为对照。所有患者术前均未接受过任何化疗、放疗及生物治疗等。

1.2 主要试剂及材料

兔抗人XIAP、cyclin D1及survivin多克隆抗体均购自美国Abcam公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 免疫组化法检测XIAP、cyclin D1及survivin的表达情况

将石蜡切片于二甲苯及100%、95%、90%、85%、75%乙醇中分别浸泡5 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2次。1%过氧化氢室温孵育10 min后，PBS洗涤3次。将切片置于枸橼酸钠缓冲液中，并于微波炉中加热15 min，PBS洗涤3次。加入山羊抗血清，室温封闭10 min，一抗过夜孵育，次日PBS洗涤3次后，二抗室温孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵蛋白工作液孵育30 min，PBS洗涤3次。DAB显色后，苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树脂封片观察。以PBS代替一抗进行染色作为阴性对照。

1.4 结果判断

XIAP及survivin蛋白主要定位于细胞质，cyclin D1蛋白主要定位于细胞核，当出现棕黄色或棕褐色颗粒时提示为阳性表达。高倍显微镜下随机观察每张切片中的5个视野，采用双盲法对染色的细胞进行计数。细胞染色强度评分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占百分比评分：根据阳性细胞占视野细胞总数的百分比进行评分，≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，≥76%为3分。根据细胞染色程度评分与阳性细胞所占百分比评分的乘积判断免疫组化结果[9]，0～1分为阴性（－），2～3分为弱阳性（+），4～6分为中等阳性（++），6分以上为强阳性（+++），其中2分及以上为阳性表达。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织和正常宫颈组织中XIAP、cyclin D1、survivin阳性表达率的比较

宫颈癌组织中XIAP、cyclin D1、survivin的阳性表达率均明显高于正常宫颈组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 宫颈癌组织和正常宫颈组织中XIAP、cyclin D1及survivin阳性表达率的比较[n（%）]

2.2 XIAP、cyclin D1及survivin阳性表达与宫颈癌患者临床特征的关系

临床分期为IB～ⅡA期、有淋巴结转移、低分化宫颈癌患者的XIAP和survivin阳性表达率均明显高于临床分期为IA期、无淋巴结转移、中高分化的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）；不同年龄、肿瘤直径宫颈癌患者的XIAP和survivin阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同年龄、肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移情况和分化程度宫颈癌患者的cyclin D1阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 XIAP、cyclin D1及survivin阳性表达与68例宫颈癌患者临床特征的关系

2.3 宫颈癌组织中XIAP、cyclin D1及survivin表达情况的相关性

经Spearman相关性分析，宫颈癌组织中XIAP与cyclin D1的表达呈显著正相关（r=0.656，P＜0.01），XIAP与survivin的表达呈显著正相关（r=0.745，P＜0.01），cyclin D1与survivin的表达呈显著正相关（r=0.672，P＜0.01）。

3 讨论

XIAP是IAP家族中唯一能够同时抑制起始阶段和效应阶段的IAP[10]。XIAP通过选择性调控caspase 3、caspase 7、caspase 9蛋白的表达，进而抑制细胞凋亡。XIAP在正常组织中几乎不表达，而在乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌等肿瘤组织中高表达[6]。本研究采用免疫组织化学法检测68例宫颈癌组织及68例正常宫颈组织中XIAP的表达情况，结果显示，宫颈癌组织中XIAP的阳性表达率明显高于正常宫颈组织，差异有统计学意义（P＜0.01），说明XIAP在宫颈癌的发生发展过程中发挥促进作用。本研究还发现，临床分期为IB～ⅡA期、有淋巴结转移、低分化宫颈癌患者的XIAP阳性表达率明显高于临床分期为IA期、无淋巴结转移、中高分化的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示宫颈癌组织中XIAP的表达可能与临床分期、淋巴结转移情况及分化程度有关。已有研究表明，XIAP抑制剂蒽贝素能够通过上调caspase 3和caspase 9的表达，诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡[11]。说明XIAP抑制剂目前已逐渐被应用于宫颈癌的治疗中。

cyclin D1是与G1期密切相关的细胞周期蛋白。cyclin D1先在G1期表达，与细胞周期依赖性蛋白激酶4（cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4）/细胞周期依赖性蛋白激酶6（cyclin-dependent protein kinases 6，CDK6）结合形成复合物，促使Rb蛋白磷酸化及核转录因子E2F进入细胞核，促进与细胞增殖相关基因的转录[7]。杨琳等[12]研究表明，p27kip1和p57kip2表达下降及cyclin D1表达升高可用于评估宫颈癌的恶性程度。本研究结果显示，宫颈癌组织中cyclin D1的阳性表达率明显高于正常宫颈组织（P＜0.01）。这一结果与杨琳等[12]的研究结果基本一致，即cyclin D1高表达预示着宫颈恶性病变。本研究还发现，不同年龄、肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移情况和分化程度宫颈癌患者的cyclin D1阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），可能与样本量较少有关。survivin是1997年Ambrosini等[8]通过基因库筛选分离出来的IAP，是目前发现的分子量最小而凋亡抑制活性最强的凋亡抑制因子。目前的研究显示，survivin能够通过抑制caspase 3和caspase 9的活性进而抑制细胞凋亡，或者通过调控细胞周期进而促进肿瘤细胞的增殖[8]。survivin在除了胚胎组织外的所有正常组织中几乎不表达，而在胶质瘤、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌中高表达[8]。Zhou等[13]研究显示，survivin在正常宫颈、宫颈炎、宫颈尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变、宫颈鳞癌组织中的阳性表达率依次呈上升趋势。本研究结果显示，宫颈癌组织中survivin的阳性表达率明显高于正常宫颈组织（P＜0.01）。本研究还发现，临床分期为IB～ⅡA期、有淋巴结转移、低分化宫颈癌患者的survivin阳性表达率明显高于临床分期为IA期、无淋巴结转移、中高分化的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示宫颈癌组织中survivin的阳性表达率与肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移情况密切相关。本研究中Spearman相关性分析结果显示，宫颈癌组织中XIAP、cyclin D1及survivin的表达两两呈显著正相关。杨德华等[14]研究表明，原发性肝癌组织中XIAP和survivin的表达呈正相关。凌春等[15]研究表明，沉默白血病K562细胞中survivin的表达能够下调XIAP的表达，进而使细胞凋亡，并造成细胞周期阻滞。崔宏[16]的研究表明，结直肠腺瘤中cyclin D1和survivin的表达呈正相关。Xie等[17]研究表明，RNA干扰survivin的表达后能够提高顺铂诱导的胶质瘤U87细胞凋亡，与下调cyclin D1表达有关。提示通过下调survivin的表达，进而抑制XIAP及cyclin D1的表达，可能成为宫颈癌基因治疗的靶点之一。综上所述，XIAP、cyclin D1及survivin在宫颈癌中高表达，且其表达两两呈显著正相关，XIAP和survivin的表达与宫颈癌的临床分期、分化程度及淋巴结转移情况密切相关。XIAP、cyclin D1及survivin在宫颈癌的发生发展过程中发挥重要作用。