有机纳米材料的应用及分析方法研究进展

林 悦，刘 倩，林振宇，江桂斌

(1.中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085；2.福州大学 化学学院 食品安全与生物分析教育部重点实验室，福建 福州 350108)

纳米技术是对纳米尺寸范围内的物质进行研究、控制和应用的技术。近年来，由于纳米技术的不断发展和应用，纳米材料已被广泛地应用于食品、生物医药、农业以及环境等领域。纳米材料由于其纳米级别的尺寸效应而具有的独特物理和化学性质，为食品、农业、工业等领域带来了新的创新发展机遇[1]。但近年来的研究也表明，纳米材料能够通过生物膜进入细胞、组织和器官，影响其正常的生理活动，甚至引发一些疾病。因此，对纳米材料的安全性研究显得尤为重要。发展纳米材料的表征与分析技术是其广泛应用和安全性研究的基础。纳米材料可分为有机纳米材料、无机纳米材料以及有机无机杂化纳米材料。目前，针对无机纳米材料，已有大量新型高效的分析和表征技术被报道。相比之下，对有机纳米材料分析方法的研究关注较少。由于有机纳米材料在有机溶剂中性质不稳定以及与基质成分的相似性，使得有机纳米材料的分析检测成为一大挑战[2-4]。然而，近几年纳米材料的应用展现出从无机纳米材料到有机纳米材料的发展趋势[5-6]。因此，对有机纳米材料的分析和表征十分重要。本文主要对目前有机纳米材料的应用概况及其分析表征方法进行了系统的归纳总结。

1 有机纳米材料的应用概况

1.1 有机纳米材料在食品工业中的应用

近年来，纳米技术以及纳米材料已广泛应用于食品工业的各个阶段[7-9]。食品添加剂的加入能够改变食品的性质结构以及延长食品的贮存期。一些具有功能性和生物活性的化合物能够被封装在纳米级别的载体中加入到食品中，从而保护其生物活性，抑制其生物降解，改善其稳定性及水溶性[10]。许多类型的有机纳米粒子能够作为一种性能良好的载体[11]，例如，德国AquaNova公司生产的一种纳米自组装的脂质体产品，能够装载维生素A、C、E、K、辅酶Q10、β胡萝卜素、异黄酮、α-硫辛酸等多种营养物质，通过改善这些营养物质活性部分的溶解度或水溶性或脂溶性，促进营养物质在食品中的分散，同时也有利于食品在人体内的消化和吸收。另外，食品中还有一些天然存在的有机纳米粒子，如牛奶中的乳清蛋白能够自组装形成40 nm左右的颗粒，而95%的酪蛋白能够自组装成50～500 nm的微胶粒。由于作为食品添加剂的有机纳米材料必须是食品级别的材料，所以工业合成的聚合物纳米粒子一般不能应用于食品中，只有一些食品级的聚合物才能应用于食品加工中。但聚合物纳米粒子可以用于食品包装[12-13]，且掺杂其它纳米材料后的复合材料能够有效保持食品的新鲜度。尤其是其优异的阻气性，适用于坚果、干粮和零食的包装[14-17]。另外，一些具有功能性的天然生物聚合物(如壳聚糖)作为食品包装材料也是一种很好的选择[18-19]。

1.2 有机纳米材料在生物医药中的应用

纳米科技的发展使纳米治疗药物也得到了迅速发展。脂质体作为药物的载体在近十几年得到了广泛应用。通常脂质体呈球形，大小在25～1 000 nm 之间，能够高效装载亲水或疏水药物，从而保护药物不受外界环境的影响。同时，易修饰易功能化的特点使其可以识别特定的目标物，或进一步改善脂质体的性质。阿霉素脂质体是美国食品及药物管理局批准的第一个脂质体药物配方，用于治疗与卡波西肉瘤有关的艾滋病。多伦多大学的郑钢课题组合成了一种磷脂包裹的卟啉有机高分子纳米材料，该材料在体内能够降解，可用于光热治疗[20-21]。多糖是一种在植物、动物、藻类、微生物中天然存在的化合物。目前，壳聚糖和淀粉是生物医学及制药中最常用的多糖纳米材料，它们具有天然的生物相容性以及可降解性，因此成为一种绝佳的纳米药物载体材料，可用于疫苗和一些口服药物的载体[22]。另外，合成的高分子聚合物纳米材料虽然一般不能用于食品添加剂中，但已被广泛地应用于生物医药行业[23-24]。与食品中作为营养物质的载体类似，它们同样可用来保护和运输具有生物活性的化合物。

1.3 有机纳米材料在农业中的应用

有机纳米材料在农业生产方面也得到了广泛应用，包括农业投入品、植物遗传育种、农产品加工等[25]。利用纳米技术可将一些有机农药或化肥纳米化，形成纳米尺寸的乳液，提高其在水中的分散性，有助于农作物的吸收[26]。Jiang课题组[27]合成了一种环保型草甘膦异丙胺纳米乳液体系，该体系能够增加草甘膦异丙胺的渗透性和吸收性。γ-氟氯氰菊酯固体脂质纳米粒子能够保持其灭虫性，且大大降低了对鱼类和植物的毒性。基于脂质体的纳米粒子已被用作一种纳米载体运输一些农药产品，以控制或降低农药的运输速度，延长农药的持效期，提高其药效[28-31]。近年来，纳米技术在植物育种方面也取得了进展。纳米材料能够作为一种基因载体，负载外源基因，实现靶向性转运，进而成功培育出转基因植物。常用的有机高分子纳米材料基因载体有脂质体、聚乙烯亚胺、壳聚糖、树枝状高分子聚合物、聚赖氨酸等[32]。另外，有机纳米材料也可作为一种动物饲料添加剂。例如，聚苯乙烯纳米粒子加入到鸡饲料中能够与饲料中的细菌结合，进而通过鸡的胃肠道和其他排泄物聚集[33]。

1.4 有机纳米材料在环境中的应用

环境中的有机纳米材料覆盖了以上所有类型，食品、农产品、医药产品中含有的有机纳米颗粒均可能通过直接或间接的方式排入自然环境中，成为一类新型的环境污染物。此部分重点介绍近年来关注度较大的微塑料。微塑料一般是指尺寸小于5 mm 的塑料微粒、微纤维、塑料薄膜及薄膜等，而尺寸小于100 nm的塑料颗粒被称为纳米塑料。如今塑料已经广泛地应用于工业、农业、建筑、包装以及人们日常生活的各个领域。2017年我国的塑料制品行业产量达到706.7万吨，其数量十分庞大，主要包括低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯等[34]。这些塑料主要被加工成包装袋、塑料管和乙烯基覆层等外壳部件。一旦被废弃后排入环境中，这些塑料通常进入水道并最终排入海洋中。之后经过长期的外界作用形成尺寸越来越小的颗粒，最后部分达到纳米级别，形成纳米塑料。这些纳米塑料很容易被浮游生物及鱼类摄入，并在体内不断累积，最终可能通过食物链进入人体内，对人体健康产生潜在的危害。而且纳米塑料具有很大的比表面积，可以作为一些有毒物质的载体，例如持久性有机污染物、金属以及农药等。这些有毒物质负载在纳米塑料上，随着海水流动而大范围扩散，对海洋生物乃至人类健康产生危害[35-37]。表1列出了有机纳米材料在食品、生物医药、农业以及环境领域中的应用。

表1 有机纳米材料的应用领域Table 1 Typical applications of organic nanomaterials

2 有机纳米材料的分析方法

检测有机纳米粒子的困难在于，其存在的样品基质与目标分析物性质相似导致两者分离困难，因此对样品的前处理方法是首要解决的一大难题。目前，分析方法研究大部分集中于无机纳米粒子，对有机纳米粒子检测方法的开发仍处于起步阶段[38,41]。但根据近期调查，纳米材料的应用表现出由无机纳米材料向有机纳米材料发展的趋势，尤其在食品、农业等领域，有机纳米材料的应用正处于快速增长的阶段，因此开发对有机纳米材料的分析检测方法愈发重要。目前对有机纳米材料的分析方法研究主要包括样品处理、分离、成像、检测等内容(图1)。

图1 有机纳米材料的分析流程及方法
Fig.1 Analytical procedures and methods of organic nanomaterials
HPLC：高效液相色谱；SEC：尺寸排阻色谱法；HDC：流动色层分析法；FFF/F4：场流分离/流场流分离技术；GE：凝胶电泳；CE：毛细管电泳；IMS：离子迁移谱；DMA：差分迁移率分析；TEM：透射电子显微镜；SEM：扫描电子显微镜；AFM：原子力显微镜；DLS：动态光散射；NTA：纳米颗粒跟踪分析；MALDI-TOF-MS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；ESI-MS：电喷雾电离质谱；Pyr-GC-MS:热裂解色谱-质谱联用技术

2.1 样品处理与分离

在对有机纳米粒子进行表征与检测前需对样品进行前处理，包括消解、分离、富集和纯化。特别是基质复杂的样品，在处理的过程中需保证待测粒子不受损坏且最大程度地被富集，以得到最佳的检测性能。常见的样品处理方法有过滤、离心等[42]。传统的过滤方法能富集样品中一定粒径范围的颗粒，通过选定不同孔径的滤膜(如0.2、0.45、1 μm)，按梯度过滤，能够较好地解决滤孔堵塞的问题。其次，超滤也能高效地富集有机纳米颗粒，选定截留分子量30 kDa的超滤管进行离心分离，能够有效去除金属离子及小分子[43]。切向流过滤(TFF)是透析的一种形式，具有稳定、快速、不易堵塞、重复性好等优点[44]，其中电辅助TFF已被用来分离蛋白质纳米粒子[45]。另外，超速离心也是一种快速富集水样中纳米粒子的方法，通过设置不同的转速进行梯度离心，能够粗略地分离不同粒径的纳米粒子[46]。但是，过滤或离心均会使样品中的其它无机纳米颗粒被富集，难以与有机纳米粒子分离，因此在过滤或离心前或处理过后仍需将二者分离。Karami课题组[47]利用密度为1.6～1.8 g·cm-3的NaI饱和溶液分离鱼样品中的微塑料及纳米塑料。由于塑料的密度低于NaI,因此经过一定时间的静置，密度较小的塑料颗粒悬浮在液体表面，密度大的其他纳米粒子(如金属纳米粒子)沉于底部。另外，从一些复杂的生物样品中提取聚合物有机纳米粒子时，还需采用消解的方法对样品进行预处理，去除基质干扰。通常采用酸性消解、碱性消解或生物酶消解等方式。但是，消解法并不能普遍适用于有机纳米粒子，因为酸、碱或其他强氧化性溶剂对基于蛋白、脂质体的有机纳米粒子具有破坏作用。无论采用哪种样品前处理方式或试剂处理样品，均需保证不破坏待测的目标纳米粒子，并且不损坏仪器的检测系统。

目前，大部分的检测方法均无法实现有机纳米粒子的原位检测，因此样品的制备技术和分离技术十分重要。除了过滤、离心这些通用的处理方法外，还有一些分离方法能够根据有机纳米粒子的尺寸、形状、电荷等物理化学性质进行比较精确的分离，例如色谱分析、场流分离(FFF)、电泳、离子迁移谱(IMS)等。其中，流动色层分析法(HDC)是色谱分析的一种方法，能与几种检测体系相结合，目前应用最广的是与紫外可见光谱(UV-Vis)相结合用于纳米粒子(如脂质体纳米粒子)的分析[48]。FFF是一种流动辅助分离技术，可以用于分离大分子纳米粒子以及微米级别的颗粒(例如细胞)。流场流分离技术(F4)是应用最广泛的FFF技术，特别适用于分离完整的超大蛋白质和蛋白质复合物[49]。电泳包括凝胶电泳(GE)和毛细管电泳(CE)，其原理是利用带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，不同的带电粒子因在电场中移动速度不同而达到分离[50]。这种技术已实现了DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的分离。另外IMS或差分迁移率分析(DMA)也可用于有机纳米粒子的分离，且IMS常与MS联合(IMMS)用于纳米粒子的分离和检测[7]。

2.2 表征与检测方法

2.2.1电镜法成像是表征纳米材料的最重要技术之一，常用的有电子显微镜(TEM、SEM)和AFM等。TEM已被用于不同条件下的乳蛋白纳米管、血清白蛋白纳米粒子以及淀粉基纳米粒子的成像表征。通过TEM能够观察到有机纳米粒子的尺寸与形状，例如淀粉基纳米粒子在TEM下可观察到50～180 nm范围内的大小[51]。同样，SEM能够得到目标物纳米粒子的尺寸、形状以及样品表面状况的高清图像。Nuruzatulifah课题组[52]采用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)观察到合成的聚苯乙烯纳米粒子呈40～60 nm的球状(图2)。另外，SEM 能够观察到基于多糖、蛋白、脂质体的纳米粒子。但是，这些有机纳米粒子必须先从样品基质中分离出来，才能得到清楚的成像结果。AFM的分辨率能够达到0.1 nm,几乎能够对任何类型表面的纳米材料进行成像，包括聚合物、陶瓷、复合材料、玻璃和生物样品，并得到高分辨率的三维轮廓图。例如，AFM已被应用于缓冲液中α-乳清蛋白纳米管分子结构成像，探测其机械性质，且分辨率可达到纳米级别，此外，该技术还用于对脂质纳米粒子的大小、形状、稳定性和动态过程进行研究[38]。

2.2.2光谱法蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型检测器，可与一些色谱分离方法联合用于无紫外吸收的有机物的检测。如Schulzova等[11]将超高效液相色谱(UHPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)和ELSD联合用于饮料中有机纳米粒子的表征与检测，得到饮料和水中聚山梨醇酯纳米粒子的检出限分别为0.5 mg/mL和0.1 mg/mL。

动态光散射(DLS)是检测纳米粒子粒径的常规方法，检测结果会受环境中尘土以及样品中聚集粒子的影响，但同时具有检测快速、简便、重复性强等优点。DLS能够对一些基于蛋白、多糖脂质体的纳米材料进行表征，同时也常应用于一些合成的聚合物纳米材料的粒径表征。Calle等[2]用DLS快速鉴别了饮料中纳米粒子的粒径，并得到了对纳米粒子粒径影响最小的前处理方式。另外，与DLS相关的还有纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术，其能够分析30～2 000 nm粒径范围的粒子[53]。

UV-Vis可用于检测在紫外可见光波长区域具有吸收谱带的有机纳米材料。HDC法能与UV检测联合用于有机纳米粒子尺寸的表征。Oosterbroek等[54]在芯片平面上结合HDC和UV吸收检测，用于一些聚合物、生物聚合物颗粒的尺寸表征。装置包含1个孔道(高1 μm、宽0.5 mm、长69 mm)、1个150 pL 注射装置和1个检测池(深30 μm、宽30 μm)用于UV吸收检测。傅立叶变换-红外光谱分析法(FT-IR)和拉曼光谱(Raman)法常被用于表征分析环境中的微塑料成分。Löeder等[55]利用基于焦平面阵列探测器的微傅立叶变换红外成像技术对环境样品中的微塑料进行分析，该方法分析速度快，可以满足小粒径微塑料的检测及区域范围的检测，实现了样品的可视化。Wu等[56]对青藏高原偏远湖泊的湖岸沉积物进行分析，并通过激光拉曼光谱从微塑料样品中鉴定出聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚氯乙烯。另外，微塑料还能用尼罗红荧光染料法进行表征和计数，但该法一般仅能测定微米级别甚至更大尺寸的高分子材料。

图3 由聚乙烯(PE)(蓝色圆圈)和顶部渥太华砂粒(绿色圆圈)组成的样品的总离子TOF-SIMS 成像图(ca.500 μm×500 μm)[57] Fig.3 TOF-SIMS image(ca.500 μm×500 μm)of total ions from a sample consisting of PE(blue circle)and Ottawa sand grains on top(green circles)[57]

2.2.3质谱法质谱正在纳米材料的分析领域兴起，并被证明具有很好的应用前景。Jungnickel等[57]用飞行时间二次离子质谱(TOF-SIMS)对模拟暴露于海浪中的聚乙烯微粒(PE)进行了分析和成像(见图3)。另外，热裂解色谱-质谱联用技术(Pyr-GC-MS)也被广泛应用于高分子聚合物的定性与定量，通过对样品进行加热使其热裂解，释放出小分子短链，根据短链分子的m/z判断样品类型。例如，用Pyr-GC-MS检测聚苯乙烯纳米粒子，能够得到苯乙烯(m/z104)、聚苯乙烯二聚体(m/z208)、聚苯乙烯三聚体(m/z312)的特征峰[58]。

色谱是一种分离有机纳米粒子的有效方法，而色谱与质谱的联用能够进一步识别这些纳米粒子。液相色谱和质谱的联用能够有效地分离和检测复杂样品中的蛋白、多肽等大分子，表明这些技术适用于表征生物聚合物纳米粒子。Schulzova等[11]将超高效反相液相色谱与高分辨率时间质谱(UHPLC-HRTOF-MS)结合，建立了一种高选择性和灵敏度的聚山梨醇酯纳米粒子的检测和定量方法。还采用实时直接分析离子源与Orbitrap MS分析仪(DART-Orbitrap MS)相结合，快速简便地检测了饮料中的聚山梨醇酯纳米粒子。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是一种高效的新型软电离生物质谱，其质量检测范围达到400 kDa以上，因此十分适用于一些多糖、多肽、高分子聚合物的检测。尽管MALDI-TOF-MS已被广泛用于分析合成聚合物的分子量和结构及组成信息，但该技术的局限性在于不能为具有高度多分散性的样品提供正确的分子量值。而色谱法与MALDI-TOF-MS的联用则能够很好地克服此缺点。Helsper等[59]将HDC与MALDI-TOF-MS联用对饮料中的脂质体纳米粒子进行表征，首先通过HDC分离出3种不同尺寸的脂质体纳米粒子，然后通过MALDI-TOF-MS分别在正离子和负离子模式下进行测定。各种类型有机纳米粒子的检测技术如表2所示。

表2 有机纳米粒子的分析技术Table 2 The analytical techniques of organic nanoparticles

3 结论与展望

随着有机纳米材料应用的不断增加，其分析与检测得到越来越多的重视。本文简述了有机纳米材料的应用领域，总结了关于有机纳米材料的分析方法，并概括了这些方法和技术的优缺点。与无机纳米材料相比，对有机纳米材料的分析方法仍被忽视，不能满足其日益蓬勃的发展需求。对于有机纳米粒子的分析检测往往并不能通过单一的技术完成，需要多种技术联用才能实现较好的分析与表征。未来还需从以下方面开展更多的工作：

① 针对更多类型有机纳米材料的分析与检测方法的开发。目前在农业、食品、生物医药等领域的有机纳米材料应用仍缺乏相关标准，给质量控制和监管带来了极大困难，尤其是缺乏可靠的分析方法对产品中的有机纳米材料进行分析和检测。因此，亟需针对不同样品介质中的不同类型有机纳米材料开发相应的分析方法。

② 大力发展有机纳米材料的色谱和质谱分析技术。质谱能够提供质量数和化学组成信息，将其与色谱、DLS、TEM等方法联用能够有效地实现有机纳米材料的分离、表征和检测，因此该技术在未来有机纳米材料研究方面具有重要的应用潜力[67]。目前关于有机纳米材料的质谱分析方法相对较少。例如，近期研究较多的微/纳米塑料，仍缺乏相应的质谱分析方法，给其定性、定量带来了困难。

③ 开发复杂介质中有机纳米材料的提取技术。对于有机纳米粒子的提取也是一大挑战。由于有机纳米粒子结构性质较不稳定，且通常展现出与样品基质(如组织、细胞)类似的组成，一些适用于无机纳米粒子的样品处理方式(如超声、化学生物降解等)并不普遍适用于有机纳米粒子的提取。因此，亟需针对有机纳米材料开发出特定的高效提取技术。

总之，有机纳米材料的快速发展和应用给分析化学工作者提出了更多的挑战和更高的要求，未来将会成为分析化学研究的一个热点。