超高效液相色谱-串联质谱法测定莲藕、莲叶、莲子、田泥与田水中12种农药残留

张新忠,陈宗懋,赵梅勤,姚月凤,绳慧珊,王新茹,周 利,罗逢健

(1.中国农业科学院茶叶研究所 农产品质量安全研究中心，浙江 杭州 310008;2.农业部茶叶产品质量安全风险评估实验室，浙江 杭州 310008；3.浙江天丰生物科学有限公司，浙江 金华 321025；4.山东农业大学 农学院，山东 泰安 271018；5.天津农学院 园艺园林学院，天津 300384)

莲藕种质资源丰富，兼具食用性和药用性，营养丰富，含有大量利于人体健康的营养成分，因特殊的风味和保健功能而广受国内外消费者欢迎。随着种植业结构调整，莲藕栽培已成为我国一些地区的特色农业[1]。近年来，干莲叶作为一种特色茶——莲叶茶在市场上也有销售。喷施除草剂等农药可防治莲藕田病虫草害，降低人工成本，提高莲藕种植的经济效益，但也可能导致莲藕及莲叶、莲子中的农药残留；另外，整个现代农业体系中农药的使用、环境的恶化导致莲藕的生长环境发生变化，田水、田泥中残留的化学农药，也可能会传递富集到莲藕及莲叶中,导致莲藕及莲叶、莲子中的农药残留，影响莲藕及莲叶、莲子质量安全。

莲藕、莲子和莲叶属于区域性特色小宗农产品，特殊性强，国内外目前对其中农药等污染物残留研究较少，仅有少量文献报道[4-9]。如王赟莘等[4]利用固相萃取(SPE)柱净化，高效液相色谱法(HPLC)测定了水生蔬菜中22种杀虫剂、杀菌剂农药残留；喻磊[5]利用固相微萃取结合气相色谱电子捕获检测器法(GC/ECD)、气相色谱质谱法(GC-MS)和HPLC分析了莲藕、荸荠和茭白中的农药残留；Miao等[6-7]对比了QuEChERS提取净化和SPE柱净化，建立了GC/ECD和GC-MS分析莲子中36种有机氯类、拟除虫菊酯类农药残留的分析方法；戴守辉等[8-9]利用加速溶剂萃取，手性气相色谱-质谱法研究了莲藕中多氯联苯手性对映体的选择性富集行为；沈迎春等[1]研究了嘧菌酯、多菌灵和丙环唑对莲藕叶斑病的防治效果和残留试验。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，UPLC-Quattro Premier XE配有电喷雾电离(ESI)源和MassLynx 4.1工作站(美国Waters公司)；高速离心机(德国Sigma公司)；电子分析天平(0.000 1 g和0.01 g，瑞士Mettler-Toledo公司)；R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；T-18高速均质匀浆器(德国IKA公司)；DFT-200手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；Vortex Genie2型涡旋振荡器(美国Scientific Industries)；MZ 2C型真空抽气泵(德国Vaccubrand公司)；6位玻璃大体积负压固相萃取装置、50 mL离心管、0.22 μm Filter Unit滤膜(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯，Honeywell Burdick & Jackson，韩国SK Chemicals)；无水硫酸钠、氯化钠(分析纯，上海试四赫维化工有限公司)；乙酸铵、甲酸(色谱纯，德国CNW公司)；纯净水(杭州娃哈哈有限公司)；BondElut C18-SPE柱(500 mg/6 mL，美国Agilent公司)；PestiCarb-SPE柱(500 mg/6 mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

10 mmol/L乙酸铵溶液：称取0.78 g乙酸铵，加入纯净水并定容至1 000 mL，溶解超声脱气，现配现用。

0.1%甲酸乙腈溶液：准确吸取1.0 mL甲酸，加入乙腈并定容至1 000 mL，混匀超声脱气，现配现用。

空白莲藕、莲叶、新鲜莲子(剥壳得到莲子肉、莲子壳)、田泥和田水均采自湖南张家界种植基地。莲藕切成1 cm以下小段，再切碎，用高速万能粉碎机打碎；莲叶先切成1 cm×1 cm左右小块，再用高速万能粉碎机打碎；新鲜莲子剥壳成莲子肉、莲子壳，再分别用高速万能粉碎机打碎；田泥去石块和植物根茎，晾干压碎过20目筛；田水用滤纸过滤掉固体颗粒；上述样品制备好均存放于-20 ℃冰箱中备用。

1.2 色谱-质谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；样品盘温度：8 ℃；流量：0.25 mL/min；流动相：0.1%甲酸乙腈(A)和10 mmol/L乙酸铵溶液(B)；梯度程序洗脱：0～1.0 min，15%～40% A；1.0～5.2 min，40%～90% A；5.2～5.3 min，90%～100% A，保持1.3 min；6.6～6.8 min，100%～15% A，平衡保持1.2 min。

电喷雾正电离-多反应监测扫描模式(ESI+-MRM)；电喷雾电压：3.0 kV；离子源温度：120 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；锥孔反吹气：N2，50 L/h；脱溶剂气：N2，650 L/h；碰撞气：Ar，0.35 mL/min；倍增电压：650 V；二级质谱母离子驻留时间：20 ms；其他参数见表1。

表1 12种农药的ESI+-MS/MS测定条件及相关信息Table 1 ESI+-MS/MS conditions for the residue determination and related information of twelve pesticides

*quantitative daughter ions(ion ratio)

1.3 样品处理

1.3.1莲藕、莲叶、莲子肉、莲子壳及田泥称取磨碎后的莲藕、莲叶、莲子肉、莲子壳或田泥(其中莲叶、莲子壳、莲子肉为5.00 g，莲藕、田泥为10.00 g)，置于50 mL塑料离心管中，加10 mL水涡旋混匀，放置30 min，再准确加入20 mL乙腈涡旋浸泡过夜，于17 400 r/min均质2 min，涡旋，加2.5 g NaCl涡旋振荡混匀后，超声提取10 min，5 000 r/min离心5 min，准确分取上层乙腈层10 mL至鸡心瓶，45 ℃下旋转蒸发浓缩近干，加2 mL乙腈超声溶解，上样至500 mg/6 mL PestiCarb-SPE柱，弃去流出液，再加20 mL乙腈-苯(3∶1，体积比)洗脱，合并接收流出液至50 mL鸡心瓶，45 ℃下旋转蒸发浓缩近干，室温下N2吹干，加1.0 mL乙腈-水(1∶1,体积比)超声溶解后，过0.22 μm滤膜至进样瓶，UPLC-MS/MS进样5 μL，基质外标法定量测定。

1.3.2田水量取50 mL田水样，上样至依次经5 mL乙腈、5 mL水活化的500 mg/6 mL BondElut C18-SPE柱上，5 mL水淋洗，10 mL乙腈洗脱，接收流出液至50 mL鸡心瓶，45 ℃下旋转蒸发浓缩近干，室温下用N2吹干，加1.0 mL乙腈-水(1∶1)超声溶解，过0.22 μm滤膜至进样瓶，UPLC-MS/MS进样5 μL，基质外标法定量测定。

1.4 标准溶液配制与标准曲线

分别称取0.010 0 g标准品，用乙腈溶解至50 mL容量瓶并定容，配制成200 mg/L的标准储备液，-18 ℃下避光保存。将12种单标储备液，用乙腈稀释混合配制成20 mg/L的中间标准溶液，然后用乙腈-水(1∶1)稀释成2.50、1.0、0.50、0.25、0.10、0.05、0.025、0.010、0.005 mg/L系列混合标准工作溶液，同时用经“1.3”方法得到的空白样品(莲藕、莲叶、莲子肉、莲子壳、田泥和田水)基质配制相应浓度的基质标准溶液，采用UPLC-MS/MS进样5 μL测定，每个样品进样3次，以12种农药的质量浓度为横坐标(X)，3次进样提取离子对峰面积的平均值为纵坐标(Y)，进行曲线拟合，并计算基质效应结果。

1.5 回收率与相对标准偏差

称取经“1.2”和“1.3”方法处理测定不含所测12种农药残留的空白样品，分别对应添加0.05 mg/L(低)、0.50 mg/L(中)和5.0 mg/L(高)质量浓度的混合标准溶液1.00 mL(相当于莲叶、莲子壳、莲子肉添加0.01、0.10、1.0 mg/kg；莲藕、田泥添加0.005、0.05、0.50 mg/kg)，田水中添加水平为0.1 μg/L(低)、1.0 μg/L(中)、10.0 μg/L(高a)和100 μg/L(高b)，所有加标样品涡旋混匀后放置2 h，以更接近于实际样品，然后按照“1.3”样品处理方法进行提取净化，每个加标水平重复6次；同时用提取净化后获得的空白样品基质溶液，配制相应浓度的基质标准溶液，基质标准外标法进行测定，计算加标回收率、相对标准偏差及方法定量下限。

1.6 实际样品测定

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件优化与裂解分析

本研究利用BEH C18柱进行分离分析，对比了甲醇、乙腈以及加甲酸作为流动相A，纯水、乙酸铵水溶液、甲酸铵水溶液等作为流动相B的效果。结果表明流动相中加入甲酸或铵盐，有助于提高化合物的离子化响应，对于茚虫威等化合物，流动相中加入铵盐比纯水和甲酸更有助于抑制[M+Na]+生成，从而有利于获得二级质谱分析时所需的母离子[M+H]+，提高二级质谱响应[11]；乙腈比甲醇洗脱能力强，柱压低更适合快速分析，同时因样品进样溶剂为乙腈-水，乙腈作为流动相时的色谱峰形优于甲醇。实验对比了不同锥孔电压(10、20、30、40、50 V)下，12种化合物准分子离子峰的色谱峰面积，结果表明大部分化合物的响应最大值在20 V或30 V条件下。选择的最佳锥孔电压见表1。

图1 戊菌唑(A)和异丙甲草胺(B)准分子离子峰的二级质谱裂解途径Fig.1 ESI+-MS/MS fragmentation pathways of penconazole(A) and metolachlor(B) quasi-molecular ion peaks

戊菌唑(m/z284.07)和异丙甲草胺(m/z284.14)的分子量接近，在低分辨率的四极杆质量分析器中无法完全通过准分子离子峰[M+H]+质荷比分离定性，而且二者的色谱保留时间一致，依靠保留时间亦无法定性，选择[M+H]+离子m/z284.1进行二级质谱裂解分析，以5 V为间隔，从5 V到50 V不断增加二级碰撞能量，研究戊菌唑和异丙甲草胺在10、20、30、40、50 V碰撞能量下的二级质谱图。通过质谱裂解首次发现戊菌唑[M+H]+m/z284.1在二级碰撞裂解下，生成子离子m/z173、m/z159、m/z123、m/z89和m/z70，推测碎片裂解途径见图1A；异丙甲草胺[M+H]+m/z284.1在二级碰撞裂解下，生成子离子m/z252、m/z176、m/z145、m/z134、m/z133、m/z132、m/z119、m/z91和m/z77，推测碎片裂解途径见图1B。由此可见，戊菌唑和异丙甲草胺虽然母离子一致，但由于化合物结构不同，二级质谱裂解途径不同，子离子碎片存在差别，最终可根据子离子不同，选择不同的母离子-子离子对对两者进行定性定量区分。

最终优化后12种农药的二级质谱分析条件见表1，以不同的母离子-子离子对提取峰面积进行定量。

2.2 样品前处理条件的优化

莲叶、莲子壳所含叶绿素较多，莲藕、莲子肉所含淀粉较多，田泥沉积物较多，且本文所选农药涉及种类多、水溶解度和极性跨度大。12种农药均易溶于乙腈、丙酮等有机溶剂，采用乙腈提取能有效降低淀粉、蛋白向提取液中迁移，而对于色素类杂质，石墨化炭黑填料是最有效的净化手段。因此本文最终采用乙腈与水混合提取，加入氯化钠盐析离心后，取乙腈层经PestiCarb-SPE柱净化，采用乙腈-苯(3∶1)洗脱，每2 mL分段接收，洗脱溶剂中苯的引入，有助于降低石墨化炭黑对含苯环结构农药的吸附，2 mL乙腈上样时，12种化合物均未流出。图2给出了不同体积乙腈-苯(3∶1)洗脱时12种农药在PestiCarb-SPE柱上的回收率，结果表明除苄嘧磺隆在4～14 mL、吡嘧磺隆在2～8 mL、戊菌唑在0～8 mL和咪鲜胺在2～16 mL流出之外，其余8种化合物均在0～4 mL流出。为保证回收率，同时考虑到基质引入后的影响，最终对莲叶、莲藕、莲子肉、莲子壳和田泥样品，采取PestiCarb-SPE柱净化，2 mL乙腈溶解上样，20 mL乙腈-苯(3∶1)洗脱接收。

图2 乙腈-苯(3∶1)不同体积下洗脱PestiCarb-SPE柱上12种农药的回收率Fig.2 Elution recoveries of twelve pesticides in PestiCarb-SPE column by different volumes of acetonitrile-benzene(3∶1)

2.3 线性关系、仪器定量下限与基质效应

在“1.2”条件下进样5 μL测定溶剂标准溶液和基质标准溶液样品，每个浓度重复进样3次，标准溶液的配制及标准曲线的考察步骤见“1.4”。实验结果表明，在0.005～2.500 mg/L(噻虫胺为0.010～2.500 mg/L)范围内，可获得12种农药的溶剂标准曲线、基质标准曲线和相关系数(见表2)，相关系数(r2)均大于0.97，以标准曲线最低浓度(S/N>10)为仪器定量下限，可得除噻虫胺的仪器定量下限为0.01 mg/L外，其余农药均为0.005 mg/L。

以12种农药在不同基质中的线性方程斜率与在乙腈-水溶剂中线性方程斜率的比值考察基质效应(ME)，结果见表2。在莲叶(0.15≤MEs≤0.71)、莲子壳(0.41≤MEs≤1.26)中基质减弱效应表现较强，在莲藕(0.39≤MEs≤1.08)、莲子肉(0.34≤MEs≤1.04)中基质减弱效应较小，尤其是色谱中较早流出的化合物，如噻虫嗪(0.15≤MEs≤0.49)、噻虫胺(0.34≤MEs≤0.58);相对而言,田泥(0.95≤MEs≤1.44)、田水(0.81≤MEs≤2.17)中未表现出基质效应或存在一定的基质增强效应。因此最终采用相应基质标准溶液进行定量分析。

表2 不同样品中12种农药的相关系数、基质效应、平均回收率及相对标准偏差Table 2 Correlation coefficients(r2),matrix effects(MEs),average recoveries(A.R.) and RSDs for twelve pesticides in different matrices

(续表2)

PesticideNo.Sample matrixr2MEsA.R./% *RSD/%LowMiddle HighLowMiddleHigh9Solvent0.993 4Lotus leaf0.994 50.69103±2.6105±5.6106±3.52.65.33.3Lotus root0.990 50.95116±14.299.0±7.684.6±10.312.27.712.2Lotus seed meat0.993 70.81104±7.7103±3.3103±2.87.43.22.7Lotus seed shell0.991 20.8790.3±3.391.2±1.894.3±3.33.61.93.5Mud0.998 71.1773.5±1.185.0±2.9104±2.71.53.42.6Field water0.992 21.0885.4±5.287.9±3.592.8±2.3a ,87.5±2.0b6.14.02.5a,2.2b10Solvent0.993 0Lotus leaf0.997 70.5081.9±5.588.7±5.293.1±2.86.75.93.0Lotus root0.992 80.9695.3±13.492.3±5.781.9±11.714.16.214.3Lotus seed meat0.991 90.7290.8±6.983.9±5.886.8±2.37.77.02.7Lotus seed shell0.992 30.7577.4±3.775.6±4.076.0±2.94.85.23.7Mud0.998 71.0538.1±2.738.7±3.555.7±3.97.19.16.9Field water0.991 91.1271.2±12.054.0±5.361.2±4.6a,57.8±5.2b16.99.77.5a ,9.1b11Solvent0.996 7Lotus leaf0.997 30.71102±13.1107±7.5105±7.212.97.16.8Lotus root0.991 01.04109±11.598.7±4.593.9±11.510.64.512.3Lotus seed meat0.995 40.94106±3.6103±2.6101±3.03.42.52.9Lotus seed shell0.987 50.98103±8.296.0±11.191.8±8.38.011.69.0Mud0.999 31.1393.9±8.496.6±6.399.2±1.89.06.51.8Field water0.989 41.0576.2±8.565.3±4.655.7±3.1a ,64.5±3.8b11.17.15.5a,5.9b12Solvent0.990 3Lotus leaf0.997 30.54107±3.5102±2.7107±2.63.32.72.4Lotus root0.998 20.6994.8±13.199.2±4.9101±11.213.84.911.1Lotus seed meat0.997 40.73102±6.5104±1.9105±2.66.31.92.5Lotus seed shell0.993 00.9392.9±4.293.2±2.094.1±1.54.52.21.6Mud0.999 41.1692.9±2.991.9±4.699.7±0.83.25.00.9Field water0.991 71.6383.0±2.487.7±3.893.4±1.6a ,85.8±3.5b2.94.31.7a ,4.1b

*spiked concentrations were 0.01,0.10 and 1.00 mg/kg for lotus leaf,lotus seed shell and lotus seed meat,0.005,0.05 and 0.50 mg/kg for lotus root and mud,and 0.1,1.0,10.0 μg/L(a) and 100.0 μg/L(b) for field water;pesticide No. were the same as that in Table 1

2.4 回收率、相对标准偏差与方法定量下限

按照“1.5”进行加标回收率试验，12种农药化合物在不同样品基质中的平均回收率(A.R.)和相对标准偏差(RSD)结果见表2。结果表明：莲叶中12种化合物的A.R.为81.9%～116%，RSD为1.5%～12.9%；莲藕中12种化合物的A.R.为81.4%～116%，RSD为4.4%～25.1%；莲子肉中12种化合物的A.R.为83.9%～107%，RSD为1.3%～14.8%；莲子壳中12种化合物的A.R.为75.6%～103%，RSD为1.6%～11.6%；田泥中除咪鲜胺的A.R.为38.1%～55.7%(<60%)和RSD为6.9%～9.1%外，其余化合物的A.R.为64.6%～104%，RSD为0.9%～9.5%；田水中除噻虫胺在低质量浓度(0.10 μg/L)无法检出，咪鲜胺和茚虫威在中、高加标水平下的A.R.为54.0%～65.3%(<70%)，RSD为5.5%～16.9%外，其余化合物和加标水平下A.R.为71.2%～101%，RSD为0.9%～16.9%。根据残留试验标准方法要求，以最低加标水平为方法定量下限(LOQ)，结果表明：田水中除噻虫胺的LOQ为1.0 μg/L之外，其余均为0.1 μg/L，12种化合物在莲藕、田泥中LOQ为0.005 mg/kg，在莲叶、莲子壳和莲子肉中LOQ为0.01 mg/kg。

2.5 实际样品的测定

3 结 论

为保证特色小宗作物莲藕的生产和食用安全，本文通过采用乙腈-水混合提取，氯化钠盐析离心，分取乙腈提取液过PestiCarb固相萃取柱净化洗脱，水样采用C18固相萃取柱直接富集净化洗脱，洗脱液浓缩定容后，超高效液相色谱-串联质谱基质外标法定量测定，建立了莲藕、莲叶、莲子肉、莲子壳、田泥和田水中12种农药残留的分析方法，并用于田间残留试验实际样本的测定。本方法符合残留分析标准(RAQCG)的要求[10]，能够满足莲叶、莲藕等样品中不同农药残留的检测要求，并对其他农产品及环境样本中12种农药的检测具有参考意义。