CRISPR/Cas技术在核酸检测中的应用进展

史 铠，雷春阳，聂 舟

(湖南大学 化学生物传感与计量学国家重点实验室，化学化工学院，湖南 长沙 410082)

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。CRISPR/Cas系统的发现可以追溯到1987年，Nakata等[1]首次在大肠杆菌的基因组中发现了串联的间隔重复序列，但在当时并未引起学术界的关注。2002年，Jansen等[2]将这一奇特的重复间隔序列正式命名为串联间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。2005年，Bolotin等[3-4]发现这些重复间隔序列来源于外援入侵的噬菌体的基因，推测CRISPR/Cas系统可能与细菌的免疫系统有关。直至2011年，Koonin等[5-7]才揭示了CRISPR/Cas系统介导的免疫机理：当病毒首次入侵时，细菌会将病毒的小片段DNA整合到自身的CRISPR间隔区；病毒再次入侵时，CRISPR转录生成一条前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后pre-crRNA被RNA内切酶切割生成含有与病毒靶标序列匹配的成熟CRISPR RNA(crRNA)。该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白(CRISPR-associated proteins)对靶标序列进行识别和降解。其中Cas蛋白对靶标序列的识别必须依赖于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif，PAM)，因此PAM在CRISPR/Cas系统中起着至关重要的作用。按Cas蛋白的组成,CRISPR/Cas系统可分为两大类：第一大类的Cas蛋白为多亚基组成的多蛋白效应复合物，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第二大类的Cas蛋白为单个效应蛋白，包括Ⅱ型的Cas9、Ⅴ型的Cas12和Ⅵ型的Cas13[8-9]。2012年，Doudna等[10]证实结合crRNA的Cas9可在体外条件下与基因组中DNA靶序列的特定位点结合并切割，由此揭开了将CRISPR/Cas系统改造为基因编辑工具的序幕。利用经过改造的CRISPR/Cas系统，研究者能够精确、高效地对基因组进行切割、替换或添加。近年来，科学家发现部分Ⅱ类Cas蛋白具有附属切割活性，并将其应用于核酸快速检测领域，取得了显著的成就[11-13]。本文主要介绍CRISPR/Cas系统在核酸检测领域的最新进展，主要涉及Cas9、Cas12a(又名Cpf1)和Cas13a(又名C2c2)3种Ⅱ类Cas蛋白(见表1)在病毒快速检测、癌症标志物的早期诊断以及遗传性疾病的诊断等领域的应用[11-14]。

表1 3种用于核酸检测的Cas蛋白的性质Table 1 The property of the Cas proteins used for nucleic acid detection

1 Cas9辅助的特异性诊断系统

基于CRISPR/Cas优异的序列识别能力，著名的合成生物学家Collins首次将CRISPR/Cas技术引入核酸分子诊断[14]，开发了一种用于低成本区分寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)亚型的纸基传感器。该传感器由3个步骤组成：扩增、ZIKV检测和CRISPR-Cas9辅助的毒株鉴别。从样本中提取RNA靶标并进行扩增，然后将扩增产物滴加到含有冻干细胞组分和生物蛋白的纸片上，激活冻干组分产生生化反应，使纸片发生肉眼可见的颜色变化(黄→紫)，从而指示ZIKV的存在。ZIKV和登革热病毒(Dengue)因临床症状相似而很难辨别[15]，在该检测平台的帮助下，研究者可在3 h内确定患者感染的病毒类型。如果检测到ZIKV，第3步将样品与冻干的CRISPR-Cas9混合。利用CRISPR-Cas9对PAM区域优异的序列识别能力，该检测平台可精准区分不同亚型的ZIKV。这种检测系统能在现场准确地进行毒株特异性的诊断，可能对实时追踪病毒流行病扩散和制定遏制策略与治疗计划的国家和全球卫生机构非常有价值。

2 Cas13a在核酸检测中的应用

2016年6月，张锋等[9]报道了一种Ⅱ类Ⅵ型CRISPR效应蛋白Cas13a。Cas13a是一种在crRNA引导下与靶标RNA特定位点结合并切割的核酸内切酶。从结构上看，Cas13a含有两个负责切割靶标单链RNA的HEPN结构域。同年10月Doudna研究组[11]发现LeptotrichiabuccalisCas13a(LbuCas13a)不仅具有对靶标RNA切割活性，而且还具有切割非靶标RNA的活性，这种非特异性切割后来被称为附属切割[12]。利用这种附属切割活性，该研究组将Cas13a用于RNA靶标检测，其检出限约10 pmol/L。但是对大多数核酸的检测方法，检出限达到amol/L数量级才具有实际应用价值[16]。2017年，张锋课题组与 Collins合作[12]将LeptotrichiawadeiCas13a(LwCas13a)与重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)结合，开发了一个基于高特异性和灵敏性的酶解锁报告探针(Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK)的核酸检测系统。在该检测系统中(图1)，靶标核酸分子经RPA和T7 RNA聚合酶转录扩增后，激活LwCas13a的附属切割活性，切割底物产生荧光信号。引入RPA显著提高核酸检测灵敏度，SHERLOCK对靶标的检出限低至2×103copies/mL(3.2 amol/L)，实现了单个核酸分子的检测。该研究组还构建出一种基于SHERLOCK试纸的快速、低成本的便携式核酸诊断工具，利用这套系统成功识别出肿瘤特有的突变，鉴定了人类基因组中的多个单核苷酸多态性。这项重磅研究成果再次证实了CRISPR/Cas核酸诊断领域的应用价值，有望对全球公共卫生产生革命性的影响。自然界中核糖核酸酶(RNase)广泛存在且十分稳定，而SHERLOCK系统的关键组分均为RNA，因此该系统对操作环境要求较为苛刻。

3 Cas12a在核酸检测中的应用

2015年，张锋等[17]发现一种Ⅱ类Ⅴ型CRISPR效应蛋白Cas12a。Cas12a可在crRNA引导下与靶标双链DNA结合并切割基因组DNA，该crRNA的长度为42～44个碱基，与Cas9系统相比简化了实验设计。2018年，Doudna等[13]发现当Cas12a特异性结合和切割目标dsDNA后，具有类似Cas13a的非特异性切割单链DNA(ssDNA)的活性，并利用Cas12a的该附属切割活性开发了一个基于DNA内切酶靶向CRISPR非特异性的报告探针(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR)的核酸检测系统。与SHERLOCK类似，DETECTR将RPA与Cas12a相结合，扩增产物激活Cas12a的附属切割活性，切割底物产生荧光信号(图2)。DETECTR能够从感染多种不同人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)亚型的样本中准确检测出高风险的HPV16和HPV18，在单核苷酸多态性分析、癌症筛查、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力。DETECTR系统中靶标及底物均为DNA，其稳定性较强，因此该系统对实验操作环境要求低，可应用于现场的快速检测。

图1 用于检测单分子水平核酸的诊断平台-SHERLOCK[12]Fig.1 Single-molecule nucleic acid detection based on SHERLOCK[12]

4 Cas13/Cas12a在多靶标检测中的应用

图3 基于Ⅱ类CRISPR-Cas蛋白附属切割活性的SHERLOCK v2系统[18]Fig.3 Multiplexed detection of SHERLOCK based on the orthogonal collateral activity of type Ⅱ Cas proteins[18]

SHERLOCK和DETECTR系统虽可快速、灵敏地检测核酸分子，但存在一些局限，例如一次只能检测一种核酸、依赖于荧光设备读取信号等。针对以上缺点，张锋等[18]发展了第二代SHERLOCK(SHERLOCK v2)系统，在保持快速、便捷和低成本等优点的基础上，实现了一次分析同时检测4种不同靶标。SHERLOCK v2由3种底物特异性的Cas13蛋白(LwaCas13a，PsmCas13b和CcaCas13b)和Cas12a组成，每种核酸靶标的扩增产物激活对应Cas蛋白切割其特异性底物，产生多色荧光信号，以实现对不同核酸靶标的荧光响应(图3)。ZIKV和Dengue因临床症状相似而很难辨别[15]，使用SHERLOCK v2能够在单一反应中同时检测出样本是否含有ZIKV或Dengue病毒。除检测靶标数量的提升，SHERLOCK v2还引入CRISPR相关酶(Csm6)进一步放大检测信号，使得该工具的灵敏度较最初版本提高了3.5倍，这对检测血液样本中循环肿瘤DNA等低丰度的靶标尤为重要。该研究组进一步开发出基于SHERLOCK v2系统的试纸条，在无需复杂仪器辅助的情况下，实现了肉眼观察检测结果。经过改进的SHERLOCK v2不仅实现了多靶标同时检测，而且提供了更高的灵敏度和更便利的检测结果读取方式。

5 总结及展望

SHERLOCK和DETECTR系统在核酸诊断方面卓越的表现，证明了CRISPR/Cas技术不仅具有强大的基因编辑能力，而且在分子诊断领域有重要的应用价值。目前，分子诊断一般包括病原的分离、核酸的提取与扩增、检测结果分析等过程，耗时长且对医疗设备和操作人员的专业水准要求很高[19-20]。SHERLOCK和DETECTR系统不需依赖贵重设备和医护人员经验，将给缺乏先进设备和训练有素人员的发展中国家带来很大便利，具有影响人类健康和全社会的真正潜力。虽然SHERLOCK和DETECTR已展现出它们在诊断中的强大力量，但在进入临床使用前，尚需进一步研究以确保诊断的准确性。此外，CRISPR/Cas技术在小分子和蛋白质等生物大分子检测方面的应用也亟待开发。随着对Cas蛋白研究的深入以及更多Cas蛋白被发现，CRISPR/Cas系统将在POCT(point-of-care testing)领域有着巨大的应用前景。