高原低氧环境下大鼠急性坏死性胰腺炎相关性肺损伤p38MAPK的表达

韩彦舟 朱海宏 郭亚民

重症急性胰腺炎(SAP)患者常伴有不可控制的全身炎症反应以及多器官功能障碍，其中以急性肺损伤最为突出，超过 50%的SAP 患者会出现严重的肺部并发症，称为SAP相关性肺损伤(SAP associated lung injury,SAP-ALI)，为SAP患者病死率高的主要原因[1-2]。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)属于MAPK家族中应激活化的蛋白激酶，主要介导应激、炎症等信号，在机体炎症反应调控过程中起着极其重要作用。有研究报道p38MAPK活化及过度表达可能是导致SAP-ALI的重要因素[3]。高原地区缺氧、低气压、紫外线强，更增加了SAP患者许多不确定因素[4]。本研究观察不同海拔及不同时间点牛磺胆酸钠诱导的急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠p38MAPK表达变化及其与SAP-ALI的关系，为高原低氧环境下SAP-ALI的诊疗提供参考。

一、材料与方法

1．动物分组及模型制备：SPF级健康雄性Wistar大鼠320只，3～4月龄，体重(200±20)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供(许可证号：SCXK2004-0006)。大鼠以专用饲料喂养(北京科奥协力饲料有限公司提供)，自由摄食和饮水。按数字表法将大鼠随机分成西安组(海拔400米)、西宁组(海拔2 300米)、兴海组(海拔3 300米)、温泉组(海拔4 500米)，每组80只。适应性饲养20 d后再随机分为假手术组及ANP 1、6、12、24 h组，每组16只。采用胰头、胰体以及胰尾部多点缓慢注射5%牛黄胆酸钠1 ml/kg体重方法建立大鼠ANP模型。假手术组打开腹腔翻动胰腺数次后关腹。假手术组于造模后6 h处死，其他各时间组分别在造模后1、6、12、24 h处死[5]，取胰腺及肺组织，液氮冷冻后置-80℃保存。

2．胰腺、肺组织p38MAPK mRNA表达检测：取冻存的胰腺及肺组织各100 mg，应用Trizol试剂提取总RNA，按RT-PCR试剂盒说明书逆转录cDNA，再以cDNA为模板，按照SYBR Premix EX Taq试剂盒说明书进行定量PCR扩增。p38MAPK正义引物序列为5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′，反义引物序列为5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′；内参β-actin正义引物序列为5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反义引物序列为5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，图像分析仪扫描，以目的条带与内参条带灰度值比作为mRNA 相对表达量。

3．胰腺、肺组织p38MAPK蛋白表达检测：取冻存的胰腺及肺组织各100 mg，应用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法定量后常规行蛋白质印迹法检测p38MAPK蛋白，以β-actin为内参。兔抗大鼠磷酸化p38MAPK一抗工作浓度为1∶80，ECL液显影。应用Image J软件获取条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值比作为蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

二、结果

1．各组大鼠胰腺、肺组织p38MAPK mRNA表达量比较：在相同海拔下，胰腺及肺组织p38MAPK mRNA相对表达量随造模时间延长而显著增加，且各时间点组间的差异均有统计学意义(P值均<0.05)；除假手术组外，不同海拔条件下大鼠胰腺及肺组织p38MAPK mRNA相对表达量随海拔的升高而显著增加，且各时间点组间的差异均有统计学意义(P值均<0.05，表1)。

2．各组大鼠胰腺、肺组织p38MAPK蛋白表达量比较：在相同海拔下，胰腺及肺组织中p38MAPK蛋白相对表达量随造模时间的延长而显著增加，且各时间点组间的差异均有统计学意义(P值均<0.05)；除假手术组外，不同海拔条件下各组大鼠胰腺及肺组织p38MAPK蛋白相对表达量随海拔的升高而显著增加，且各时间点组间的差异均有统计学意义(P值均<0.05，表2，图1)。

讨论高原气候的主要特点是低气压、低氧分压、寒冷、干旱、多风、辐射强和温差大，大气压和氧分压随着海拔高度的增加而逐级降低[6]。在这种恶劣的环境条件下，一旦发生胰腺炎，由于肺脏对血氧含量变化特别敏感，更容易引起肺损伤的发生[7]。高原环境下出现低氧血症、呼吸窘迫、肺毛细血管通透性改变等是高原地区AP患者肺损伤共同的病理生理基础和临床特征[8]，因此明确SAP-LI的发病机制迫在眉睫。

表1 各组大鼠胰腺组织、肺组织p38MAPK mRNA的表达

注：与假手术组比较，aP<0.05；与同海拔1 h组比较，bP<0.05；与同海拔6 h组比较，cP<0.05；与同海拔12 h组比较，dP<0.05

表2 各组大鼠胰腺组织、肺组织p38MAPK蛋白的表达

注：与假手术组比较，aP<0.05;与同海拔1 h组比较,bP<0.05；与同海拔6 h组比较,cP<0.05;与同海拔12 h组比较,dP<0.05

图1 西安组(1)、西宁组(2)、兴海组(3)、温泉组(4) ANP 1 h大鼠胰腺(上)、肺组织(下)p38MAPK蛋白的表达

MAPK包括4种亚型，其中p38MAPK是1993年Brester等发现的由360个氨基酸组成的蛋白，在机体应激、缺氧、炎症反应调控过程中具有极其重要的作用[9]，被认为是多条信号途径的交汇点和共同通道。研究发现SAP引发的成人呼吸窘迫综合征(ARDS)及多器官组织功能障碍等并发症的发生与多种细胞因子及炎性递质的作用有关[10]。刘君等[11]发现p38MAPK信号转导通路与SAP-ALI有着密切的关系；Werner等[12]研究证明，SAP-ALI与肺组织内大量中性粒细胞积聚、活化、产生大量的促炎因子有关，活化的中性粒细胞在介导AP肺损伤中起关健作用；Chen等[13]研究表明，抑制ANP大鼠p38 MAPK的活化，可减少其炎症细胞因子TNF-α、IL-1β释放，从而改善ANP的炎症反应，降低SAP-ALI发生率。

本研究结果显示，造模后ANP可引起大鼠急性肺损伤，同时伴有p38MAPK活性及基因表达水平显著增加，且其增加与海拔的升高呈正相关，这种变化贯穿于SAP-ALI发病的整个过程，表明p38MAPK信号转导通路对SAP-ALI的发生、发展具有重要意义。