免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测两种饮料中双酚A含量

王 勇,黄紫乐,李 蓉,吴 冰,郑传发,陈定虎,邱德义

(中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广东中山 528403)

双酚A(Bisphenol A,BPA),学名为2,2-二(4-羟基苯基)丙烷,主要用于生产多种高分子材料。在塑料制品的制造过程中,添加双酚A可以使其具有无色透明、耐用、轻巧和突出的防冲击性等特性,因此也广泛用于饮料的包装、奶瓶、水瓶等日用品的制造过程中[1]。每年,全世界将近生产2700万吨含有双酚A的塑料[2]。然而其安全性问题成为了公众关注的焦点,研究发现双酚A属于一种环境激素,能够产生环境污染问题[3-5]。它具有模拟生物体内激素的作用,影响并干扰生物体内分泌系统的正常功能,导致人和动物的生殖系统发育不良,生育能力下降,并引起各种生理异常[6-7]。长期大量接触双酚A,会对肾脏、肝脏、脾脏、胰腺和肺等多个器官系统产生损害,而且它对人体的影响是累积的、不可逆的,是一种持续性的危害[8-11]。

2011年我国明确规定禁止生产、进口及销售含双酚A的婴幼儿奶瓶[12]。但是到目前为止,我国还没有食品中双酚A卫生标准和检测方法标准。我国 GB 13116-1991《食品容器及包装材料用聚碳酸酯树脂卫生标准》和GB 14942-1994《食品容器包装材料用聚碳酸酯成型品卫生标准》规定食品容器及包装材料中双酚A(蒸馏水)的溶出量小于等于0.05 mg/L[13-14],上述两部国家标准对于食品中双酚A限量具有一定的参考价值。

目前,关于双酚A含量检测的研究主要集中在环境类、食品包装材料和食品容器等方面[7-9];食品中双酚A检测相比较环境类双酚A的研究而言较少[15-16],而且没有国家标准和AOAC检测方法;而复杂基质饮料中双酚A含量检测的研究则更少[17]。豆奶是大豆经研磨后,萃取性状良好的呈乳白色至淡黄色的乳状液体制品。豆奶含有丰富的优质蛋白质及多种人体所需的微量元素。橙汁富含维生素、矿质元素、膳食纤维等营养成分,有较高的保健价值;且橙汁具有诱人的色泽和香气,有较好的市场前景。然而到目前为止,没有关于豆奶和橙汁中双酚A测定方法的研究,目前比较多的研究采用固相萃取法提取食品中的双酚A,但是其步骤比较复杂,而且特异性不高。本研究首次采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱法联用技术检测豆奶和橙汁饮料中双酚A含量,对检测饮料类复杂基质食品中双酚A含量具有参考作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双酚A免疫亲和柱 柱容量500 ng/支 美国VICAM公司;1.5 μm玻璃纤维滤纸 美国3M公司;0.22 μm有机相滤膜 上海安谱公司;乙腈 色谱纯，德国Merck公司;甲醇 色谱纯，德国Merck公司;氯化钠 分析纯，广州化学试剂厂;磷酸氢二钠 分析纯，广州化学试剂厂;磷酸二氢钾 分析纯，广州化学试剂厂;氯化钾 分析纯，广州化学试剂厂;实验用水 为美国Millipore-Q制备的超纯水;双酚A标准品 美国Supelco公司，纯度>99%;豆奶和橙汁饮料 市场上购买,分别选购不同厂家生产的塑料瓶装和玻璃瓶装饮料各5种。

WATERS Acquity UPLC超高效液相色谱仪-荧光检测器 美国WATERS公司;离心机 德国Eppendorf;免疫亲和柱分离6位泵流操作架 中检维康公司;高速均质器 18000～22000 r/min 美国Warning公司;涡旋振荡器 德国IKA公司;电子天平 感量:0.0001 g，德国SARTORIUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的提取 准确量取混匀的豆奶或橙汁饮料样品15 mL,置于50 mL 离心管中,准确加入15.0 mL甲醇,混匀,振荡提取30 min,离心5 min(4000 r/min)。准确量取上清液10 mL于50 mL容量瓶中,用 pH7.4 磷酸缓冲溶液定容至50 mL,备用。

1.2.2 样品净化 免疫亲和柱活化处理:提前取出保存于4 ℃的免疫亲和柱,放置于室温下,恢复室温。将免疫亲和柱连接于10.0 mL玻璃注射器下。将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以约2 mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2～3 mL空气通过柱体。准确量取4 mL免疫亲和柱活化液活化亲和柱,流速为1～2 mL/min,直至2～3 mL空气通过柱体。以2～3 mL/min流速用5.0 mL纯水淋洗柱体1次,弃去全部流出液,并使2～3 mL空气通过柱体。以2～3 mL/min流速用10.0 mL pH7.4 PBS溶液淋洗柱体,待最后2～3 mL溶液充满柱体时,停止加压,用塞子堵住底部出液口,待用。活化后的免疫亲和柱在1 h内使用。

将活化后的免疫亲和柱连接于10.0 mL玻璃注射器下。准确移取20.0 mL样品提取液注入玻璃注射器中,将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以约2 mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2～3 mL空气通过柱体。以2～3 mL/min流速用10.0 mL水淋洗柱体1次,弃去全部流出液,并使2～3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL 80%甲醇洗脱,流速为1～2 mL/min,收集全部洗脱液于样品瓶中,待上液相色谱仪分析。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:Thermo C18柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱温:30 ℃;样品室温度:30 ℃;进样体积:10 μL;流速:400 μL/min。流动相:甲醇-水(60∶40,v/v),荧光检测λex=228 nm,λem=310 nm。

1.3 数据处理

运用SAS分析软件对实验获得的数据结果进行差异显著性分析(新复极差法)。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

检测液体样品双酚A的前处理的方法比较多,主要有液液萃取法、固相萃取法、多功能净化柱分离法等。考虑到豆奶和橙汁饮料样品基质较为复杂,为了尽量减少样品提取溶液中大量杂质的干扰,本研究选取特异性较高的免疫亲和柱分离法。免疫亲和柱分离法是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。因其特异性较高,一般而言,净化处理的效果较好。本研究按照免疫亲和柱生产厂家美国VICAM公司推荐的亲和柱活化和样品净化程序操作(见1.2.2 样品净化),结果表明,免疫亲和柱分离法能够有效排除豆奶和橙汁饮料中复杂基质的干扰。

2.2 色谱条件的优化

本实验选择Thermo C18柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)用于色谱峰分离,获得了良好的分离效果。本实验对流动相进行了选择,最初用乙腈和水为液相色谱分析的流动相,结果对双酚A的分离效果不大理想,最终选择甲醇和水作为流动相,并且通过优化甲醇和水的比例,最终确定甲醇-水(60∶40,v/v)为流动相,可很好实现双酚A标准物质分离,双酚A峰形尖锐,峰对称性好。双酚A标准品溶液的色谱图如图1所示。

图1 双酚A标准溶液的高效液相色谱荧光检测谱图(5 ng/mL)Fig.1 Chromatograms of standard solution for BPA(5 ng/mL)

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线、检出限和定量限 准确量取适量用二甲基甲酰胺(DMF)配制的浓度为1.0 mg/mL的标准储备液,用乙腈-水(10∶90,v/v)稀释成质量浓度分别为1.0、5.0、25.0、100.0、300.0 ng/mL的标准工作液,在上述色谱条件下进行分析测定。以双酚A的峰面积对标准品的相应浓度进行回归分析。结果显示双酚A的质量浓度为1.0～300.0 ng/mL时,线性关系良好,线性回归方程为:y=0.0256x-0.0324,相关系数(R2)为0.9998(如图2所示)。在1 ng/mL添加水平时,化合物峰的信噪比均大于3,故将其定为检出限。在3 ng/mL添加水平时,化合物峰的信噪比均大于10,且回收率、相对标准偏差(RSD)等各项指标均满足食品理化检测残留分析的要求,故将其定为定量限。

图2 双酚A的标准曲线图Fig.2 The standard curve of BPA

2.3.2 方法的精密度和回收率 取15.0 mL豆奶和橙汁饮料样品,分别添加1.0、4.0、16.0 ng/mL 3个添加水平进行回收率和精密度实验,每个添加水平做6个平行样品,平均回收率为82.5%～104.6%之间,RSD值为2.3%～6.4%,方法的重现性较好(表1)。

表1 样品加标回收率和相对标准偏差Table 1 Recovery rate and relative standard deviation for BPA in samples and CV

2.4 实际样品分析

分别选取玻璃瓶装和塑料瓶装的不同款式的豆奶和橙汁饮料,按照本研究方法进行双酚A含量检测,结果表明玻璃瓶装的豆奶和橙汁饮料中双酚A含量均小于检出限1 ng/mL,而某款塑料瓶装的豆奶和橙汁饮料检测出极其微量的双酚A,豆奶和橙汁饮料中双酚A含量分别为1.44、1.57 ng/mL(表2、图3、图4)。根据我国的GB 13116-1991《食品容器及包装材料用聚碳酸酯树脂卫生标准》、GB 14942-1994《食品容器包装材料用聚碳酸酯成型品卫生标准》规定食品容器及包装材料中双酚A(蒸馏水,回流6 h)的溶出量小于等于0.05 mg/L[13-14],可以判定本研究中塑料瓶装豆奶和橙汁中双酚A含量极其微量,处于可接受水平(小于0.05 mg/L),可认为是塑料瓶中含有较低的双酚A的本底。

表2 不同包装豆奶和橙汁中双酚A含量(ng/mL)Table 2 BPA content in different packed samples of soymilk and orange juice(ng/mL)

图3 某款塑料瓶装豆奶样品中双酚A的高效液相色谱荧光检测谱图Fig.3 Chromatograms of BPA in one kind of soymilk packed in plastic bottles

图4 某款塑料瓶装橙汁样品中双酚A的高效液相色谱荧光检测谱图Fig.4 Chromatograms of BPA in one kind of orange juice packed in plastic bottles

3 结论

本研究建立了检测豆奶和橙汁饮料中双酚A含量的免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测方法,样品经甲醇提取、离心、pH7.4磷酸缓冲溶液稀释后,用双酚A免疫亲和柱净化,用高效液相色谱仪测定。实验结果表明,在1.0～300.0 ng/mL的浓度范围内，双酚A的浓度与峰面积的线性回归方程为y=0.0256x-0.0324,R2为0.9998，检出限为1 ng/mL，平均回收率为82.5%～104.6%，相对标准差为2.3%～6.4%,该方法能够实现双酚A与样品基质的良好分离。方法学评价结果表明,该方法的灵敏度、准确度、重复性均较好,抗基质干扰能力强,适合豆奶和橙汁饮料中双酚A含量的检测,同时为其它种类的饮料中双酚A含量的检测提供参考。

本实验分别选取玻璃瓶装和塑料瓶装的不同款式的豆奶和橙汁饮料,按照本研究方法进行双酚A含量检测,其中某款塑料瓶装的豆奶和橙汁饮料检测出极其微量的双酚A,其双酚A含量分别为1.44、1.57 ng/mL,可能与饮料不同、包装材料本底中含有双酚A的含量不同有关。