胰岛素样生长因子结合蛋白5对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响＊

王利娟，支运来

高血压是心血管疾病的一种，目前高血压的治疗主要是采用药物治疗，药物治疗只能暂时控制血压的升高，并不能根本改变高血压的发生、发展。近年来关于高血压发病机制的研究已经证实其与血管重构密切相关，血管重构使得大动脉发生病变，是高血压发生、发展的重要病理基础。细胞增殖，迁移，以及体积的增大和基质的重新合成，重新排列导致了血管重构［1］。血管重构最典型的特征是血管平滑肌细胞过度增殖和肥大，腔径缩小，血管壁单位面积受到的压力增大即血压升高。因此，能够引起血管平滑肌细胞过度增殖或肥大的因素都可能影响高血压的发病。

目前有关胰岛素样生长因子结合蛋白5（insulin-like growth factor binding protein-5，IGFBP-5）的研究主要集中在其对癌细胞过度增殖的作用［2］，也有研究证明，它对正常的组织细胞具有促增殖，凋亡和组织重构的作用［3］。IGFBP-5在心血管疾病的研究中甚少，该研究主要分析IGFBP-5过度表达与高血压大鼠血管重构之间的关系，旨在进一步探讨IGFBP-5引起血管平滑肌细胞过度增殖的分子机制，为高血压的治疗提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 VSMCs的培养和鉴定 取4周龄、雌性、体重200～250 g的SHR和WKY称重后用2%的苯巴比妥腹腔注射麻醉，用眼科剪取胸主动脉，纵向剪开血管，小心刮去血管内膜。把主动脉剪成1 mm×1 mm的小块放入到培养瓶的底部，用20%FBS的DMEM培养基培养，待显微镜下观察有细胞长出时换液。镜下观察细胞为长梭形，即为血管平滑肌细胞。细胞长满培养瓶时用0.25%胰酶消化传代，用3－7代的VSMV进行后续实验。

1.2 免疫印迹法检测蛋白表达 参照FERMENTAS公司BCA蛋白测定试剂盒使用步骤说明书，提取各组全细胞蛋白。配制SDS分离胶和浓缩胶电泳。以β－actin作为内参，内参表达一致，则表明上样量均一。用Image J软件分析蛋白条带密度，以目的蛋白和内参密度的比值分析蛋白表达水平的变化。每组实验重复6次。

1.3 MTT法检测IGFBP-5的促细胞增殖作用

用浓度梯度为 0、50、100、200 ng/ml的 IGFBP－5 处理培养好的WKY细胞24 h后。每孔加入5 mg/ml MTT 20μl继续培养4 h，弃上清，每孔加DMSO 150μl溶解蓝色的甲瓒颗粒，多用酶标仪测定570 nm吸光度 （OD570）。设定对照组 OD570为100%，计算各实验组的增长率。细胞增长率（%）=（实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。每组实验重复5次

1.4 统计学分析 应用GraphPad Prism 5.0统计软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示。两组间比较采用t检验，三组以上均数比较进行单因素方差分析（one-way analysis of varience，ANOVA），用Turkey法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SHR和WKY两种大鼠VSMC中IGFBP-5表达量的比较 如图1A所示，与WKY组相比较SHR 组 IGFBP－5 的表达量显著增高 （＊P＜0.05，n=6）。结果提示，SHR组IGFBP－5的高表达可能和高血压的发生、发展有关。

2.2 IGFBP-5对VSMCs增殖的影响 如图2所示，WKY组细胞的增殖率较空白组分别是25.9%，81.5%，＊P＜0.05；129.6%，＊＊P＜0.01。 结果提示，IGFBP－5对WKY组具有明显的促VSMCs增殖的作用。

图 1 Western Blot检测WKY组和SHR组IGFBP-5表达量的变化

图 2 不同浓度梯度IGFBP-5处理的WKY细胞24 h后MTT法检测细胞增殖率

3 讨论

目前有关IGFBP－5的研究主要集中于其在肿瘤中的作用，它的表达量不仅对肿瘤的预后和治疗有重要影响而且还能对肿瘤的早期诊断具有重要意义［4］。在早期乳腺癌的诊断中，IGFBP－5 已经作为其中一个诊断指标被应用到临床中［5］。在肿瘤中的研究证实，IGFBP－5既存在于细胞质中，也存在于细胞核中，该因子在不同位置发挥作用主要是作为转录子，促进某种基因的表达，从而发挥其促细胞增殖的作用，不同的细胞具体机制还尚不明确。有待于进一步的研究。

现有的研究表明，IGF－1能够促进血管平滑肌细胞的增殖，而高血压的发生主要体现在血管重构［6］。 IGF－1 和 IGFBP－5 同属于 IGFs调节轴的组成部分，IGFBP－5是否是通过调节IGF－1来起到调节细胞增殖的是后续实验将要解决的问题。有关IGF/IGFBP在心血管疾病中起到何种作用，科学界目前存在争议，Ricketts曾报道，在健康的成年人体内IGF1和IGFBP-5的量对心血管疾病是没有影响的［7］。 然而，Urbonaviciene等研究人员发现 IGF1和IGFBP-5在体内的表达量和早期动脉粥样硬化发生有密切的关系，并且能够影响到动脉粥样硬化的发展［8］。 该实验的研究结果显示 SHR大鼠VSMCs中IGFBP-5的表达量显著增高并且IGFBP-5能够促进VSMCs的增殖，提示IGFBP-5的高表达和高血压的发生密切相关同时为IGFBP-5可能够促进高血压的发展这一课题研究提供了新的论据。高血压的发病机制复杂，可能与内分泌异常，遗传因素，神经功能紊乱等多种因素密切相关，目前认为血管重构是高血压靶器官损害的重要机制，因此探讨血管重构的分子机制，是高血压治疗的关键靶点。

综上所述，高血压的发生和发展与IGFBP-5的表达上调密切相关，但还需进一步研究其具体机制。