不锈钢网对脐带间充质干细胞贴壁及增殖数量影响的实验研究

高健伟，郭红燕，吕昕刚

自从人脐带间充质干细胞出现以来，逐渐成为人们的研究热点；但干细胞的培养扩增还存在较多问题，很多因素都可以导致原代干细胞体外培养失败（如选择培养基、血清、脐带质量、无菌情况、技术操作等等情况），即使成功培养MSCs也会出现生长不良，数量少等情况，影响实验效果及结果。笔者采用事先预制好的不锈钢丝网置入贴壁后的脐带组织中进行原代培养，观察细胞贴壁的效果和细胞生长情况以及形态变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 不锈钢网（市售，型号304，规格1 mm×1 mm×1 mm），DMEM/F12（HyClone）（图 1），青霉素和链霉素 100×（Solabio），15%FBS（Gibco），培养皿（美国康宁），倒置显微镜（100×），荧光倒置显微镜（100×），细胞计数板。

图 1 预制不锈钢网

1.2 培养皿孔数和不锈钢网的处理 全部采用6孔培养板，所有培养板只能用同一种培养基，共2板，1孔为一份标本，共12份标本。不锈钢网常规洗洁精清洗3遍，放入数控超声仪内超声处理30 min，清水再冲洗3～5遍，最后纯水冲洗3遍烘干，高压无菌灭菌锅消毒备用。

1.3 培养观察时间 时间观察点分别是7 d，10 d，15 d，20 d，25 d，记录细胞游出数量情况和细胞形态的变化情况。

1.4 脐带采集和培养 人脐带间充质干细胞原代培养采用组织块贴壁法进行，分为：A组为正常培养组，B组为置入不锈钢网组。选用足月、健康产妇的新鲜、无菌的新生儿脐带长约15 cm，用无菌4℃恒温盒储存运输，即刻消毒，用PBS（含1∶1000的青霉素和链霉素）反复冲洗表面血迹和血管内血迹，清洗彻底干净，随后用组织剪剪取干净、清亮、饱满部分的脐带，每一段长约1 cm，挑选取用12段用PBS再次反复冲洗。冲洗干净后用血管钳和眼科剪细心分离先将脐带静脉和动脉去除，然后去除羊膜，剩余即为华通胶。取无菌一次性培养皿用眼科剪将华通胶一般剪成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，平均分别种在一次性无菌6孔的培养板底部，随后把培养板放在37℃，5%CO2恒温孵育箱中1.5～2.5 h。1.5～2.5 h 后取出在超净操作台上，A 组用加液器缓慢小心加入DMEM/F12培养液 （含1∶100的青霉素和链霉素）；B组在组织块上方置入无菌的不锈钢网，将组织块适量轻触压住，然后小心加入DMEM/F12培养液 （含1∶100的青霉素和链霉素）。倒置显微镜下观察未见异常后置于37℃，5%CO2恒温孵育箱内培养，分时间阶段计数细胞数量。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。 计量资料以（x±s）表示，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞计数情况 在相同的培养条件下，采用足月、健康产妇的新鲜、无菌、健康的新生儿脐带。以每厘米脐带培养进行比较计数，6孔培养板置倒置显微镜上观察细胞形态及结构变化；同时用细胞计数板进行计数并记录结果。A组和B组之间对比对细胞数量分析差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同培养基细胞计数（每 cm 脐带，A 组：×104/cm，B 组：×106/cm）

2.2 人脐带MSCs形态学特性 人脐带华通胶行组织块贴壁法，DMEM/F12培养液培养，进行连续不同时间阶段观察发现［1，2］。两组共同点：形态均一，呈条索状或菱形生长，体积较大，大多数平行生长。两组不同点：A组镜检发现干细胞贴壁稀疏，细胞融合及细胞排列松散，细胞层数少［3，4］；B 组发现细胞贴壁时间短，增值快，细胞生长旺盛，数量明显增多，细胞融合及细胞排列紧密感明显，多数可出现多层细胞。见图2～7。

图2 A组单纯DMEM/F12培养

图 3 B组不锈钢网加DMEM/F12培养

图 4 A组培养7 d（荧光倒置显微镜10×）

图 5 B组培养7 d（荧光倒置显微镜10×）

图 6 A组培养15d（荧光倒置显微镜40×）

图 7 B组培养15 d（荧光倒置显微镜40×）

2.3 不锈钢网对原代细胞培养的影响 通过两种方式进行原代干细胞培养发现：B组细胞原代培养获得干细胞数量比A组要多；细胞生长速度迅速和体外增殖扩增较快，结构形态一致性强，不锈钢网对原代干细胞培养无形态学影响［1］。对A、B两组行细胞爬片荧光染色荧光倒置显微镜观察：细胞形态结构对比无异常图（图 8，9）。

图 8 A组爬片（荧光倒置显微镜40×）

图 9 B爬片（荧光倒置显微镜40×）

3 讨论

人脐带间充质干细胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）由脐带的华尔通胶或叫沃顿胶（Whartoncs jelly，WJ）经贴壁处理培养所得，是具有自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，在脊髓损伤治疗过程中参与神经的修复，促进多种有利因子的产生，在脊髓组织内可以进行迁移、整合、调节、分泌等作用，在脊髓损伤的修复治疗方面较其他干细胞治疗更具有明显优势［5-12］，成为目前干细胞实验研究和临床研究的焦点和热点。但干细胞的培养扩增还存在较多问题，很多因素都可以导致原代干细胞体外培养失败（如选择培养基、血清、脐带质量、无菌情况、技术操作等），即使成功培养MSCs也可出现生长不良，数量少，收集困难等情况影响实验效果。

该实验主要是讨论如何促进组织贴壁，如何获得和增加干细胞的数量。既往人们为了促进组织贴壁大部分采用各种贴壁因子试剂在培养板内进行涂抹，如增加多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶、肝素、谷氨酰胺、硅胶、凝胶、粘连纤维蛋白、地塞米松、氢化可的松等［1，11，13，14］，即使使用上述试剂，仍使干细胞数量较少，其生长缓慢等情况出现，同时因为操作技术和价格高等问题限制其应用，导致实验结果不理想，细胞数量不足；于是采用事先预制好的不锈钢网压住脐带组织块防止飘浮进行体外原代培养，可以获得大量的干细胞，解决了细胞数量来源不足和细胞培养困难等问题。

在培养过程中不同时间段A、B两组放于倒置显微镜和荧光倒置显微镜下观察发现B组细胞生长形态良好，细胞生长迅速，细胞体积明显增大，集落群体明显，细胞密集，形态均一，细胞状态良好，生长旺盛，体外增殖较快等多种优点［11，15，16］。 通过以上A、B两组观察形态结构未见明显异常，形态学一致。

市售不锈钢网型号304，规格1 mm×1 mm×1 mm大小，市场销售较多，价格便宜，实用方便，操作简便易学，无腐蚀锈斑，是进行干细胞贴壁培养的良好材料，为实验研究和临床研究解决了细胞数量来源不足等问题，在早期细胞贴壁培养过程中起到了关键作用。