疫苗及其在水生动物疾病预防中的应用（四）

文/王玉堂

上接2018年9期

四、鱼类免疫佐剂的研究及其前景

免疫佐剂简称佐剂，是先于抗原或与抗原同时使用时，能非特异性地改变或增强机体产生免疫应答，增强抗原的免疫原性，而本身并不引起机体产生免疫应答，可以积极发挥辅助作用的一类物质。近几年来，随着免疫学研究的不断深入，渔用减毒活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的研究逐步深入，也促进了疫苗佐剂研究的迅速发展。

疫苗佐剂作为生物反应调节中的免疫调节剂，可刺激机体产生一定的非特异性免疫反应，且无毒副作用、无毒素残留。目前，对于新型疫苗佐剂开发，不仅要对疫苗特点、结合方式和载体选择等方面进行研究，还要对佐剂本身的毒性、免疫效率发挥和持久性等方面进行研究，使其更好地与疫苗配伍，以增强或改变机体的特异性免疫应答，提高免疫保护效果。因此，开发研制新型疫苗免疫佐剂以增强疫苗的免疫效力，并减少疫苗的毒副作用将是未来发展趋势。

近几十年来，随着渔用疫苗的研发和应用，与渔用疫苗密切相关的渔用免疫佐剂的研究也越来越受到重视。目前，已研制出的新型工程疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答。随着疫苗的研发不断深入，特别是分子生物学技术的迅速发展，渔用口服疫苗佐剂的研究也日益成为渔药研究的热点。目前，人们研究出多种渔用口服免疫佐剂，常见的有聚合微球体、免疫复合刺激物、霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素和细胞因子等。陈昌福等以莨菪碱作为佐剂口服免疫接种草鱼后，发现受免鱼血液中吞噬活性、血清中凝集抗体细胞效价和活菌攻毒后的免疫保护率均显著提高。Jimenez等虹鳟病毒性出血败血症病毒G蛋白DNA疫苗与IL-8共同免疫虹鳟，发现IL-8能促进受体细胞因子的分泌，提高免疫力。此外，脂质体、维生素、壳聚糖、中药多糖等均被报道有良好的佐剂性。

（一）水产用口服免疫佐剂的作用机制

佐剂具有调控病原固有的免疫原性、改变抗原构型、加快免疫应答的速度和延长持续时间、改变免疫球蛋白的种类和亚类、提高免疫反应强度、诱导机体产生特异性免疫、消除免疫耐受、减少免疫副反等作用，从而控制或改变机体针对抗原的免疫反应类型和状态，使体液免疫转变为细胞免疫。可见，免疫佐剂是生物反应调节剂中的免疫调节剂，非特异性免疫刺激作用是使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件，如果这种作用过度或过强，必然会出现毒副作用。

佐剂增强机体对抗原的特异性应答是一个复杂的过程，目前关于渔用口服疫苗免疫佐剂的研究还侧重于是否具有佐剂性，其作用机制还有待于进一步研究。但畜禽的佐剂作用机制对其机理的探讨具有指导意义。佐剂作用机理主要包括6个方面：一是起免疫调节作用，主要通过调节机体内细胞因子的升高或降低来控制辅助性T细胞（Th）的分化，从而调控机体免疫应答反应。二是起储存抗原作用，延长抗原在体内的存在时间和保持对免疫系统的长久刺激作用。三是起抗原呈递作用，佐剂能维持抗原构象的完整性，增强其呈递和刺激作用。四是起靶向性作用，通过抗原呈递细胞（APC）将抗原传递到免疫效应细胞。五是诱导CD8+细胞毒性T细胞（CTL）应答。六是影响呈递抗原的树突状细胞（DC），提高免疫应答和有效的记忆性免疫。

（二）常用的水产口服免疫佐剂研究应用状况

1.聚合微球体

目前，聚合微球体主要有聚乳酸乙醇乙酸（PLGA）、聚乳酸—聚乙二醇共聚物（PELA）、聚乳酸（PLA）和聚丙交酯乙交酯（PLG）等，它们都是纳米大小，有很好的生物相容性，可以吸附多种抗原，并将其呈递到APC，增强机体免疫力，而且毒副作用小。微球可以避免消化酶对疫苗的影响，并起到缓释作用，提高疫苗的利用率，因此，聚合微球体是一类很有潜力的口服疫苗佐剂。

1996年就已有报道，PLGA被用于口服疫苗佐剂免疫大西洋鲑。近年来，PLGA作为口服疫苗免疫佐剂的研究应用较多。Tian等将质粒疫苗用PLGA包裹，研究PLGA微囊对日本比目鱼的淋巴囊肿病病毒的免疫影响，结果显示，口服微囊后10天～90天，鱼体的所有组织内已表达了主要衣壳蛋白RNA和主要衣壳蛋白。此外，与裸露的质粒疫苗相比，使用微囊包裹的质粒疫苗在第1周到24周显著增强了比目鱼血清免疫应答。银鲫口服PLGA包裹的嗜水气单胞菌疫苗后，其血清抗体效价可达28，且在300天后还可检测到较高水平的血清抗体效价。另外，PLGA作为载体和饲料添加剂对虹鳟的抗病能力也有显著提高。

目前，PLA和PLG作为渔用口服疫苗佐剂的研究报道还较为鲜见，但PLGA作为渔用口服疫苗佐剂已在水产养殖业上广泛应用。张小红等将PELA-OmpK微球疫苗应用于斜带石斑鱼，结果显示，口服PELA-OmpK的斜带石斑鱼的黏液抗体效价显著高于口服OmpK组；初次免疫30天后，用病原菌感染，PELA-OmpK组的相对保护率（62.5%）显著高于OmpK组（12.5%）。任燕等研究了PELAOmpK对鲫鱼的口服疫苗免疫效果，发现微球疫苗加强免疫鲫鱼4周，对活菌攻击的相对保护率为70%，而口服OmpK蛋白组和空白对照组全部死亡。

2.免疫复合刺激物（ISCOMS）

ISCOMS是由皂苷（puilA）、油脂、胆固醇和抗原复合后形成的颗粒，其能够快速有效地将抗原呈递给免疫系统，增加被APC摄取的效率与ISCOMS合用的抗原必须含有较多的疏水基团。

ISCOMS作为疫苗佐剂应用于渔业的研究较常见。方勤美等用嗜水气单胞菌重组β-hemA-IS-COMS对鳗鲡的浸泡免疫，ISCOMS组的鳗鲡保护率高达100%，显著高于其它佐剂组（62.5%）和未加佐剂组（50%）。袭晖等将β-hemA-COMS应用于鳗鲡的口服免疫，研究发现，β-hemA-COMS显著提高于鳗鲡淋巴细胞的增殖转化能力，对机体免疫后，进行一次攻毒和二次攻毒实验，两次攻毒实验均在免疫开始后第30天进行，结果显示，一次免疫攻毒存活率是44.4%，二次免疫攻毒实验存活率为100%。因此，ISCOMS作为渔用口服免疫佐剂具有广阔的应用前景。

3.霍乱毒素（CT）

CT是霍乱弧菌的主要交界处因子，有很强的免疫原性，由A、B两种亚基组成的AB5型六聚体蛋白，B亚基（CTB）无毒，并可有效刺激机体分泌抗毒素抗体，具有佐剂性。CTB主要是通过Th2型应答TgA和TgG等来实现佐剂性。另外，CTB还可通过环腺苷酸蛋白激酶A和炎性体依赖白介素-1信号促进Th-17细胞应答。目前，关于CTB的研究大多在小鼠身上，Yu等将CTB的cDNA与轮状病毒和大肠杆菌的菌毛抗原基因重组，使其表达在土豆中，小鼠食用转基因土豆后，体内产生了抵抗病原苏打的免疫血清及抗体。李明峰等用螺杆菌热休克蛋白A与CTB的融合蛋白对小鼠进行口服免疫，发现其在小肠内被迅速吸收，并刺激机体产生了较高滴度的特异性抗体。Lei等研究了CTB作为佐剂与pgsAHAI混合、经口服免疫小鼠后，发现CTB组小鼠在血清与粪便中HA的特异性IgG和IgA显著提高，且在致命剂量的H5N1攻击下，小鼠仍能存活；并有研究表明，以CTB作为佐剂与维氏气单胞菌的胞外凝集素一起对斑带副鲈进行口服免疫，发现CTB组的抗体效价水平显著提高，免疫保护率高达70%，并能有效防止维氏气单胞菌引进的组织损伤。

4.大肠杆菌不耐热肠毒素（LTB）

LTB是大肠杆菌产生的一种不耐热肠毒素，与CT结构相似。研究表明，LTB能够识别细胞表面的神经节苷脂以及其它受体，与抗原联合使用，增强机体对抗原的摄取，提高免疫应答能力。Companjen等利用LTB作为佐剂，对鲤鱼进行免疫，发现与对照组相比，实验组的血清效价显著提高。

（三）影响水产用口服免疫佐剂效果的因素

1.佐剂种类、剂量及次数

佐剂的种类有以下几种：

（1）铝盐佐剂

铝盐佐剂是一类无机盐，可与抗原形成复合物，并在注射部位形成抗原贮存库，避免机体对抗原的清除作用，同时降低抗原的释放速度，使其能长时间稳定地刺激相关免疫细胞，从而增强机体体液的免疫反应。在疫苗免疫中广泛应用，且效果较好的铝盐佐剂有氢氧化铝胶的磷酸铝佐剂。铝盐佐剂主要在机体的体液免疫中发挥作用，对细胞免疫效果较弱，适用于依靠抗体提高免疫保护的疾病疫苗中。虽然铝盐佐剂应用较广泛，但也很多存在一些问题，如抗原在吸附铝胶时，常使其结构发生变化而推动活性，在动物注射部位容易形成脓肿甚至溃烂，且启动机体体液免疫应答时的速度较慢。铝盐佐剂在鱼类疫苗中也有应用。肖淋淋等研究结果显示，将铝胶佐剂与福尔马林灭活的嗜水气单胞疫苗混合免疫异育银鲫后，与不添加佐剂疫苗相比，可有效增加机体的抗体生成量。

（2）油性乳剂

将一定比例的矿物油、稳定剂和乳化剂混合起来，再与抗原按比例混合制成的油水乳剂即为油性乳剂。包括弗氏佐剂、佐剂-65、白油Span佐剂和MF-59等，其中应用较广泛的为弗氏佐剂。弗氏佐剂是含油的一种，其最大特点是具有较强的免疫增强效应，是应用最为广泛的实验用佐剂。乳油佐剂在生物体内主要作为递送抗原的载体，同时也是抗原长期的贮存库，可有效阻止机体对抗原多肽的破坏，使抗原缓慢释放，从而持续刺激机体产生较高的免疫力。其不足之处是，乳油佐剂中的油可以对注射部位的组织造成损伤，产生脓肿甚至溃烂，而且油乳佐剂疫苗存在稳定性差、不易注射等缺点。张林等研究结果显示，将添加乳油佐剂的嗜水气单胞菌灭活疫苗接种到中华鳖后，可提高中华鳖的抗体效价，并在攻毒试验中可使中华鳖获得较好的免疫保护力。张俊等研究结果显示，将白油佐剂与海豚链球菌灭活疫苗一起免疫罗非鱼后，与不添加佐剂的疫苗相比，可显著提高前者的血清抗体效价。

（3）蜂胶佐剂

蜂胶是由一些树木及植物等的幼芽分泌的树脂和蜜蜂上腭分泌物、花粉等组成的一种天然物质。其中主要含有酮类、酸类、酚类等无机化合物，也含有多种氨基酸、脂肪酸、酶及维生素等有机物。蜂胶可作为一种良好的免疫佐剂，通过增强吞噬细胞的吞噬能力和补体活性，增加白细胞的产生和抗体的生成量，激活中枢免疫器官和增强抗体活性等方式来提高机体免疫应答能力，因此，其在增强机体免疫应答能力方面发挥重要作用，包括非特异性免疫应答和特异性免疫应答。Chu将添加蜂胶的福尔马林灭活嗜水气单胞菌疫苗注射银鲫后，与注射不添加任何佐剂菌体疫苗的银鲫相比，可显著提高前者的血清抗体滴度、白细胞吞噬活力以及获得较好的相对免疫保护率。郝贵杰等研究表明，将温和气单胞菌灭活疫苗与蜂胶混合注射中华鳖后，发现可显著提高机体的血清抗体效价，并可使中华鳖获得较高的免疫保护率。肖淋淋等在蜂胶佐剂对异育银鲫嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫增强试验研究中发现，蜂胶佐剂可快速地刺激机体产生较高的抗体效价，表明蜂胶佐剂可有效增强异育银鲫的免疫保护力。

（4）微生物佐剂

微生物佐剂主要有脂多糖、分枝杆菌等。

细菌毒素：脂多糖是细菌内毒素，其中类脂A主要起佐剂作用，有促进巨噬细胞分泌单核因子和调节巨噬细胞表面抗原表达等作用。大肠杆菌不耐热肠毒素和霍乱毒素都具有较强的黏膜免疫原性。Hbert等研究表明，将山羊的IgG和灭活鲶鱼爱德华杆菌作为抗原，分别与霍乱毒素B亚单位偶联后，通过腹腔注射斑点统治尾鱼回，发现二者能够表现出良好的免疫佐剂效应。

葡聚糖：葡聚糖广泛应用于水产动物疫苗免疫中，其中包括酵母葡聚糖和β-1，3葡聚糖等。葡聚糖可显著提高机体细胞的免疫应答和体液免疫应答。Aakre等研究表明，将β-1，3葡聚糖与福尔马林灭活的杀鲑气单胞菌疫苗混合注射大西洋鲑后，可显著提高大西洋鲑的血清抗体效价。Rirstad等研究发现，将来源于酵母的M-葡聚糖与两种杀鲑气单胞菌疫苗和1种杀鲑弧菌混合后，对试验鱼进行攻毒试验，结果表明，添加M-葡聚糖的3种疫苗可以显著提高试验鱼的免疫保护力。

分枝杆菌菌苗：分枝杆菌广泛用于兽用佐剂疫苗中，其有效成分为细菌中的胞壁酰二肽（MDP）。MDP具有很强的佐剂活性，可增强机体的体液免疫和细胞免疫。Hoel等研究证实，将从分枝杆菌分离的极性糖伏脂与福尔马林灭活的杀鲑氢单胞菌混合注射大西洋鲑后，发现其可显著提高机体的血清抗体效价，并且对鱼体具有较小的副作用。

肽聚糖：肽聚糖主要来自革兰氏阳性菌的细胞壁，在鱼类等动物的非特异性免疫中发挥重要作用。微生物作为佐剂主要依靠细胞壁上的肽聚糖发挥作用，如胞壁酰二肽（MDP）和胞壁酰三肽（MTP）等。MDP是从分枝杆菌细胞壁上提取的一种具有免疫活性的物质，可刺激相关免疫细胞的增殖，也可刺激机体的非特异防御机制。但其在动物体内的应用，会引起机体产生赖特尔过敏综合症。MTP广泛应用于疟疾疫苗，并取得较好效果。郭玉娟等研究表明，将添加肽聚糖的饲料投喂已注射嗜水气单胞菌灭活免疫的彭泽鲫后，可显著提高其溶菌酶活性、白细胞吞噬活性和抗体效价，并获得较高的免疫保护率。

（5）分子佐剂

分子佐剂是指那些可与抗原混合注入机体，引起机体产生非特异性免疫反应或增强机体特异性免疫应答的各种相关免疫分子。

细胞因子：细胞因子是由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长分化、调节免疫功能的生理活性的细胞调节蛋白质。它包括淋巴细胞产生的淋巴因子和单核巨噬细胞产生的单核因子，以及其它相关细胞产生的细胞因子。多数细胞因子都具有免疫佐剂效应，目前研究最多细胞因子主要有白细胞介素（Ⅱ）、干扰素（IDN）、肿瘤坏死因子（INF）等。近年来，相关鱼类免疫的一些细胞因子已先后被证实。白介素1（IL-1）可以增强机体对抗原的初次和再次免疫应答，促进IL-2的产生等。白介素2（IL-2）可刺激多种相关免疫细胞，能够提高机体的免疫应答能力。白介素3（IL-3）可增强机体对T细胞依赖性抗原的免疫应答。IL-12可诱导激活T细胞和NK细胞等的增殖及分化。C-干扰素（IFN-C）主要参与ThO细胞的分化来调节免疫应答，在机体抗病毒、免疫调节等方面发挥重要作用。Buonocore等研究表明，将齿舌鲈的IL-β与鳗弧菌疫苗混合后注射舌齿鲈后，可以延长机体产生特异性抗体的时间。Yin等研究显示，将IL-1的一段多肽与演尔马林灭活的嗜水气单胞菌共同注射鲤鱼后，可显著提高其抗体生成量。

热休克蛋白：热休克蛋白在机体免疫应答中有着递呈抗原的作用。有关研究结果证实，将热休克蛋白质和单纯疱疹病毒糖蛋白质B部分肽段偶联注射小鼠后，发现其可刺激免疫细胞生产特异性的抗体，从而有效提高小鼠的免疫能力。

CpG-DNA佐剂：CpG-DNA是指主要由甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤苷酸组成的一段具有免疫刺激性的DNA序列，该序列可激活巨噬细胞和NK细胞，诱导分泌多种细胞因子，刺激B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖、分化及抗体的产生，还可诱导细胞的凋亡。因此，CpG-DNA序列在增强机体非特异性和特异性免疫应答等方面发挥着重要作用。郭爱珍等添加CpGDNA的犬瘟热病毒灭活疫苗注射机体后，发现CpG-DNA诱导机体产生的抗体量显著高于蜂胶组和铝盐组，周顺等研究表明，将16种人工合成的CpGDNA与新城疫弱毒疫苗免疫雏鸡后，可显著提高鸡的体液免疫水平。

（6）中草药佐剂

人们发现许多中药的活性成分，如苷类多糖等有很好的免疫调节作用。中药多糖主要有银耳多糖、牛膝多糖、黄芪多糖等，具有增强单核细胞吞噬功能和T细胞、B细胞免疫功能的作用。此外，中草药如人参、当归及芦荟等均有佐剂作用，Chen等研究表明，将甘草素添加到福尔马林灭活嗜水气单胞菌中，经腹腔注射翘嘴鳜后，可使其获得较好的免疫保护效果。

（7）其它佐剂

维生素E和硒：维生素E和硒能够促进抗体的产生，可以有效地提高机体的免疫力。曹永长等实验表明，将灭活疫苗与维生素E混合均匀免疫鸡群后，发现鸡体内抗体量显著高于不添加维生素E的鸡群。

免疫刺激复合物：免疫刺激复合物（ISCOM）是由QuilA、胆固醇和抗原组成的相对稳定且具有较高免疫活性和抗原递呈等功能的复合体。ISCOM可作为一种良好的免疫佐剂，它可以增加抗原与机体递呈细胞的相互作用，增强吞噬细胞功能；还可诱导细胞毒素性T淋巴细胞和辅助性T细胞的克隆应答；同时，也能较早和持续地诱导抗体的高效表达，而且ISCOM在增强细胞免疫和体液免疫方面均发挥重要作用。这对防止病原微生物对机体的入侵有着非常重要意义。

佐剂自身、佐剂与抗原相互作用，以及佐剂对特定抗原的免疫应答等均能引起不良反应，如ISCOM中含有溶血成分，微生物源的佐剂有一定毒性，细胞因子佐剂可介导炎症反应等。同时，佐剂的使用剂量会影响疫苗效果。过多，佐剂会包裹疫苗抑制免疫刺激；较少，则无法直至佐剂的效应。此外，免疫的次数也必须适当，过多会严重影响佐剂作用效果。

2.动物本身的状况

不同的动物具有各自的遗传因素和遗传抗病性。因此，在渔用佐剂使用时，不能只通过对某种水产动物进行了受益人实验，就说明这种佐剂普遍适用于其它水生动物，需要进行大量的实验来对某种佐剂进行验证，确保它们的免疫效果。此外，动物的年龄、健康状态、生理机能等均应是佐剂使用的考虑因素。

还有一些口服疫苗免疫佐剂的生产操作十分复杂、价格昂贵、使用量大，以及外环境因素的影响等问题，使得疫苗佐剂得不到广泛应用。

以上所述的佐剂种类很多，效果也是确定的，但也有一些不可避免的缺点，如油性佐剂存在粘滞性、稳定性及注射局部反应等问题，氢氧化铝不足以诱导弱抗原的免疫反应，且不能诱导细胞介导的免疫。

理想的佐剂是以最小的免疫刺激可引起适当的免疫促进作用，且无不良反应。与合成药物相比较，中药具有不良反应少、毒副作用小、多效性、双向调节性和无特异性的特点。因此，具有免疫调节活性，可增强机体免疫力的中药正在成为理想的新型疫苗佐剂。中药对免疫系统发挥多方面的重要调节作用，它不仅能激活T细胞、B细胞、巨噬细胞（M5）、自然杀伤细胞（NK）、细胞毒细胞（CTL）、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子生成。其中，中药有效单体免疫佐剂有许多优点：一是成份单一，容易阐明作用机制；二是相互干扰少；三是分子结构明确（可以进一步研究结构与功能的关系，通过结构改造、化学修饰等方法有望开发出更好的佐剂）；四是量效关系、质量标准控制十分容易。中药提取分离技术的进步，为中药单体佐剂的开发创造了条件。

中药免疫佐剂虽然在安全性质方面表现出一定的优越性，但是在作用机理方面的研究却显得十分薄弱。目前，中药免疫佐剂作用机理主要从中药免疫佐剂对免疫系统的免疫器官、免疫细胞及免疫因子的作用来阐述其免疫佐剂的作用机理。但是，中药免疫佐剂是通过什么方式影响免疫系统的，还有待于进一步研究。只有在了解作用机理的基础上，才能更加合理地开发使用中药免疫佐剂。随着对免疫系统的深入认识和分子受体机制的了解，在分子受体层面上阐述中药佐剂作用机制是必要的。中药医理论、免疫调节、中药免疫佐剂作用机理等方面的理论研究成果，将使得中药佐剂的开发更加高效，进而研制成具有实际应用价值的高效、低毒、经济的新型中药免疫佐剂。