高迁移率族蛋白1促进原发性肝癌细胞增殖

蔡惠美，曹文瑜*，黄玉钿，傅建英，马燕燕

(福建医科大学附属福州市第一医院 1.消化内科; 2.病理科, 福建 福州 350000)

侵袭和转移是威胁肿瘤患者生命的主要因素，也是恶性肿瘤的基本生物学特征[1-3]。高迁移率蛋白B1(high-mobility group box-1 protein, HMGB1)是一种肿瘤转移促进蛋白，存在于多种生物体内，在人体内广泛分布于淋巴组织、肝、脑、肺、心和肾等组织中，在进化中高度保守[4]，其表达和肿瘤的侵袭与转移有密切的关系[5-6]。晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end product, RAGE)是细胞表面分子中免疫球蛋白超家族的成员之一，RAGE参与多种肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[7-8]。而RAGE是HMGB1的唯一受体。关于HMGB1和RAGE蛋白在原发性肝细胞癌中的表达情况国内外报道较少。

本研究旨在探讨肝癌组织及细胞中HMGB1及RAGE的表达，研究HMGB1抑制肝癌细胞凋亡的可能作用途径，分析肝癌的可能致病机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织样本及细胞：选择2012 年1月至2016 年6月福建医科大学附属福州市第一医院消化科收治的25例原发性肝癌患者作为研究对象，25例患者中男20例，女5例，年龄38～76岁，平均(52.5±11.6)岁。瘤体≤5 cm者15例，瘤体>5 cm者10例。以距癌灶边缘5 cm为界分别留取癌灶组织和非癌组织。所有标本均经病理组织学证实为原发性肝细胞肝癌。该研究已获得单位伦理委员会的审查批准书及受试者签署的知情同意书。HepG2细胞系(中科院上海细胞研究所)。

1.1.2 试剂及试剂盒：鼠单克隆抗体HMGB1(ab11354)和RAGE(ab54741)(Abcam公司)。S-P免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；胎牛血清、链霉素和青霉素、DMEM和RPMI1640高糖培养基(Gibco公司)；重组人HMGB1蛋白(Active Motif公司)；MTT试剂盒(碧云天生物公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学法HMGB1和RAGE表达：肝癌及癌旁组织免疫组化以经典的S-P 法进行。HMGB1工作浓度1∶100，RAGE工作浓度1∶200，每片滴加HMGB1一抗，4 ℃冰箱过夜；DAB显色。以PBS液代替一抗作为阴性对照；用已证实的HMGB1染色阳性肝癌标本作为阳性对照。

1.2.2 HepG2和L02细胞系的培养：HepG2和L02细胞系分别采用含有10%胎牛血清及链霉素(100 U/mL)、青霉素(100 U/mL)的DMEM和RPMI1640高糖培养基，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中进行培养。

1.2.3 HepG2和L02细胞系中HMGB1及RAGE表达的检测：将HepG2和L02细胞系按1.5×106个/mL密度接种到60 mm培养皿中进行培养，待细胞贴壁之后提取细胞总蛋白。采用Western blot检测两株细胞中HMGB1及RAGE的表达情况，以β-actin为内参。用Quantity One软件进行光密度分析。

1.2.4 rhHMGB1对HepG2细胞增殖能力的检测：将HepG2细胞按1.0×104个/孔密度接种到96孔板中进行培养，分别采用不同浓度重组人HMGB1蛋白(recombinant human HMGB1 protein，rhHMGB1)(0、10、50和100 μg/L)处理细胞24 h以及50 μg/L的rhHMGB1处理不同时间(0、12、24和36 h)。采用MTT试剂盒测定HepG2细胞增殖能力，自动酶标仪490 nm处检测吸光度(A)值。其中每组设置6个复孔，实验重复3次。

1.2.5 rhHMGB1对HepG2细胞RAGE和NF-κB表达影响的检测：将对数增殖期HepG2细胞按1×105个/孔接种到6孔板中进行培养，分别采用不同浓度rhHMGB1(0、10、50和100 μg/L)处理细胞24 h以及50 μg/L的rhHMGB1处理不同时间(0、12、24和36 h)，每组设置两个复孔。处理结束后提取细胞总蛋白，采用Western blot检测不同处理组细胞RAGE和NF-κB的表达水平，以β-actin为内参。用Quantity One软件进行光密度分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HMGB1和RAGE在肝癌组织和癌旁组织中的表达

HMGB1和RAGE蛋白在肝癌组织的阳性表达率(蛋白表达样本数/总样本数)为64%和72%，分别显著高于癌旁组织的20%和28%(P<0.05)(表1，图1)。

2.2 HepG2和L02细胞中HMGB1及RAGE的表达

HepG2细胞中HMGB1及RAGE的表达量均明显高于L02细胞(图2)。

2.3 rhHMGB1对HepG2细胞增殖能力的影响

随着rhHMGB1浓度的升高及处理时间的延长，HepG2细胞的增殖率显著增强(图3)。

2.4 HepG2细胞经rhHMGB1处理后RAGE和NF-κB的表达

随着rhHMGB1浓度的升高及处理时间的延长，细胞中NF-κB和RAGE的表达显著上调(图4)。

表1 HMGB1和RAGE在肝癌组织及正常 肝组织中的表达

*P<0.05 compared with normal liver tissues.

3 讨论

HMGB1除了在多种炎性反应中起重要调控作用外，在乳腺癌、前列腺癌和胃癌等肿瘤的侵袭转移中起到了关键性的调控作用，通过其主要受体RAGE和Toll样受体对下游一系列抑癌或促癌因子的作用，影响肿瘤的发生发展[9-11]。而在肝脏相关肿瘤中，HMGB1的研究尚处于起步阶段。现有的大部分研究仅从临床病例及组织中得到HMGB1与肝癌的相关性，而从细胞及动物模型上对HMGB1和RAGE在肝癌的发生发展过程中所起作用和相关机制尚缺乏深入研究。

A.HMGB1 expression in tumor tissues; B.HMGB1 expression in normal tissues; C.RAGE expression in tumor tissues; D.RAGE expression in normal tissues

图1肿瘤与正常组织S-P免疫组化结果
Fig1S-Pimmunohistochemistryresultsoftumorandnormaltissues

*P<0.05 compared with control group

*P<0.05 compared with control group

本研究采用免疫组化的方法对肝癌组织和癌旁组织中HMGB1及RAGE的表达进行了观察。结果表明，肝癌组织中HMGB1的表达阳性率远高于癌旁组织中。同时肝癌组织中RAGE的表达率也明显高于癌旁组织。上述结果表明，HMGB1和RAGE在肝癌组织中呈现高表达的趋势。对肝癌细胞系HepG2和普通正常肝脏细胞系L02中HMGB1和RAGE表达水平的检测结果表明，在正常培养条件下，HepG2细胞中HMGB1和RAGE蛋白水平明显高于L02细胞。这也与肝癌组织中HMGB1和RAGE高表达结果相一致。因此推断HMGB1和RGAE对于肝癌的发生发展存在重要相关性。此外，向HepG2肝癌细胞系中加入rhHMGB1，采用MTT法检测处于不同浓度rhHMGB1以及不同处理时间作用下HepG2细胞的增殖率，结果表明，随着rhHMGB1浓度的升高及处理时间的延长，HepG2细胞的增殖率显著增强。同时，细胞中RAGE和NF-κB蛋白的表达显著上调。这提示HMGB1能刺激HepG2肝癌细胞的增殖，HMGB1可能通过与其受体RAGE结合, 进一步激活NF-κB信号通路, 从而促进肝癌细胞增殖。这也提示HMGB1-RAGE轴可能成为肝癌治疗的潜在靶点。

总之，HMGB1-RAGE轴可能参与了人类肝癌的发生、发展及增殖机制，随着对HMGB1-RAGE轴研究的深入，其可能成为肝癌治疗的潜在靶点。