针灸对CTX小鼠骨髓细胞DNA修复基因XRCC1和ADPRT的调控作用❋

于冬冬，牛云云，路 玫，付雪鸽，滕迎春

(1. 河南中医药大学针灸推拿学院, 郑州 450008； 2. 河南中医药大学国际教育学院, 郑州 450008；3.河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000)

环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是目前广泛应用于肿瘤化疗的一类烷化剂药物,其在杀伤肿瘤细胞作用的同时，可引起正常细胞尤其是增殖旺盛的骨髓造血干细胞DNA链内和链间的交叉连接，干扰其转录与复制，从而造成DNA的损伤，最终导致骨髓抑制。受损细胞DNA主要通过修复和凋亡来保护其正常的生理功能和稳定的遗传性状[1]。碱基切除修复(base excision repair，BER)是主要的DNA损伤修复途径，其对烷化剂、电离辐射和类辐射药物等导致的单链断裂具有修复作用。作为BER的主要参与者，XRCC1编码的蛋白质与DNA连接酶Ⅲ相互作用，可修复DNA单链断裂。研究表明，XRCC1在肿瘤细胞中的表达阳性率越高，则DNA修复能力越强[2]。ADPRT作为碱基切除修复系统的核心蛋白成员，激活后与XRCC1相互作用共同完成DNA损伤修复过程。课题组前期研究已证实，针灸可显著上调化疗机体骨髓细胞DNA切除修复蛋白-polβ的蛋白表达及RNA转录，提高碱基切除修复能力，发挥其抗CTX化疗损伤，改善骨髓抑制的作用[3]。本研究通过观察针灸干预后XRCC1、ADPRT的含量变化，探讨针灸抗骨髓抑制又一新的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用清洁级雄性昆明种(KM)小鼠40只(由郑州大学医学院提供，SCXK(豫)2010-0002)，体质量(20±2) g，按体质量随机分为空白组、模型组、针刺组、艾灸组各10只，均在清洁级动物实验室分笼饲养，每笼5只，饲养温度21～ 25 ℃，相对湿度60%，光照时间12 h，国家标准固体混合饲料喂养，自由饮食。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂 注射用环磷酰胺(山西普德药业有限公司生产)0.9%NaCl溶液(山东鲁抗辰欣药业有限公司)；小鼠XRCC1、ADPRT ELISA检测试剂盒(河南华豫教学实验仪器用品营销部提供)；过氧化物酶(HRP，上海晶纯生化科技股份有限公司生产)；四甲基联苯胺(TMB，上海晶纯生化科技股份有限公司生产)。

1.2.2 仪器 超净工作台、冻存管、EP管、薄片离心机 SHANDON、枪头、电子天平、移液器，1 mL、5mL一次性注射器，秒表、医用橡胶手套、烧杯、鼠板、鼠夹(自制)、华佗牌针灸针(规格0.19 mm×10 mm，苏州医疗器械用品有限公司生产)、特制美容艾条(规格0.4 cm×25 cm，河南南阳卧龙艾绒厂生产)等。

1.3 造模

采用环磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制小鼠模型，除空白组外，其余各组腹腔注射CTX100 mg/(kg·d)(按照小鼠体质量0.02 ml/g用药量，注射浓度为5 mg/mL的CTX溶液)，后分别在首次注药的24 h、48 h后再行CTX注射，连续3 d停药4 h后模型即成[4]。 空白组腹腔注射等量0.9%NaCl溶液。

1.4 取穴及治疗方法

取穴：大椎、膈俞、肾俞、足三里。小鼠穴位定位参考《中国兽医针灸学》[5]，并模拟大鼠穴位定位法，大椎位于背部正中第7颈椎与第1胸椎之间；膈俞位于第7胸椎下两旁，肋间左右侧各1穴；肾俞在第2腰椎下两旁，左右侧各1穴；足三里位于小鼠后肢膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处，左右各1穴[6]。

针刺组按照各组造模时间的先后顺序，造模完成后施以针刺治疗，各组小鼠配对同时进行，采用管式进针法直刺，进针3 mm，留针6 min。艾灸组在造模完成后开始艾灸治疗，各组配对同时进行，用美容细艾条点燃后，在距离穴位皮肤2 cm处固定悬灸3 min。模型组、空白组每日抓取陪同固定6 min，不予治疗，均每日1次，连续5 d。

1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测CTX小鼠骨髓细胞中基因XRCC1和ADPRT含量

治疗5 d结束后于第6天取材。在超净工作台上取双侧股骨剔除肌肉和结缔组织，经0.9%氯化钠溶液冲洗2遍后，用无菌眼科小剪刀上端剪口，用5 mL注射器抽取3.6 mL的0.9%氯化钠溶液注入骨髓腔，反复2～3遍冲洗其全部有核细胞，离散成单个细胞悬液，将骨髓细胞悬液注入冻存管内密封好，再放入-80 ℃低温冰箱保存，以备检测骨髓细胞中XRCC1和ADPRT的含量。用ELISA法进行检测：①从室温平衡 20 min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4 ℃铝箔袋中；②设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；③样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液40 μL(即样本稀释5倍)，空白孔不加；④除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体 100 μL， 用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min；⑤弃去液体吸水纸拍干，每孔加满洗涤液静置1 min，甩去洗涤液吸水纸拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)；⑥每孔加入底物 A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育 15 min；⑦每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔的OD 值。

1.6 统计学方法

2 结果

表1显示，与空白组比较，模型组、针刺组和艾灸组小鼠骨髓细胞DNA中XRCC1、ADPRT表达含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明CTX化疗致小鼠骨髓细胞DNA受损；与模型组比较，针刺组和艾灸组小鼠骨髓细胞DNA中XRCC1、ADPRT表达含量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明针刺和艾灸能够上调CTX化疗小鼠骨髓细胞DNA中XRCC1与ADPRT的表达含量，提高细胞DNA碱基切除修复能力，对抗CTX化疗所致细胞DNA损伤，减轻骨髓抑制。与艾灸组比较，针刺组XRCC1、ADPRT含量较高，差异无统计学意义(P>0.05)，但针刺有优于艾灸的趋势。

表1 针灸对CTX小鼠DNA碱基切除修复基因XRCC1、ADPRT含量的影响

注：与空白组比较:1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3 讨论

环磷酰胺(CTX)是具有细胞毒性的化疗药物，可引起骨髓抑制、外周白细胞减少等一系列不良反应。中医并无“骨髓抑制”这一病名，根据症状表现属于“虚劳”范畴。《黄帝内经》曰：“正气存内，邪不可干”“恬淡虚无，真气从之，精神内守，病安从来”，表明疾病的产生与机体内在的机能状态密切相关。病机虽复杂，无外乎先后天之本失调与气血阴阳不和，治疗原则当以培补先后天之本为主，兼以补气调血。选取诸阳之会大椎穴，激发诸阳经之气，补正气祛邪气，调畅经络之气使其补而不滞。血会膈俞，取其养血生血、健脾补心之力。取肾脏之气输注的肾俞、足阳明胃经的合穴及胃腑的下合穴足三里，共奏培补先后天之本、补脾益肾、调补气血之功。

XRCC1是X射线交叉互补修复基因1的英文简称，是第一个分离出影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基因，在广泛参与化学诱变剂与电离辐射所致 DNA损伤后的单链断裂修复和碱基切除修复过程中扮演着极为重要的角色[7]。XRCC1作为具有桥梁作用的蛋白，共有3个功能域，即位于中间的BRCT-Ⅰ域、XRCC1 C端的BRCT-Ⅱ域和N端的功能域。其中BRCT-Ⅱ域能与DNA连接酶Ⅲ绑定在一起形成复杂的连接体，BRCT-Ⅰ域可与PARP相互作用，N端的功能域与DNA聚合酶β结合，分别参与DNA碱基切除修复及DNA单链断裂修复的过程[8-9]。本研究结果显示，针灸能显著提高CTX化疗小鼠骨髓细胞DNA中XRCC1的表达含量，揭示其具有促进碱基切除修复能力，改善骨髓抑制的作用。

ADPRT是二磷酸腺苷核糖转移酶的英文简称，是真核细胞中催化聚二磷酸腺苷核糖化的细胞核酶。其通过识别受损断裂的DNA链，且使多种核受体蛋白(包括自身)发生多聚ADP核糖化，从而参与BER过程。当ADPRT迅速结合在DNA断链处时，引发自身多聚核糖化而被激活。被激活的ADPRT与XRCC1共同募集DNA聚合酶β、DNA连接酶Ⅲ，并使其紧密连接形成复合体，完成DNA损伤修复过程[10]。ADPRT表达下降时，提示在BER过程中，部分DNA损伤未能得到有效修复，受损的DNA增加了基因组的不稳定性与发生突变的频率，当同时存在其他重要的基因突变或缺失时则导致细胞的癌变[11]。因此保持ADPRT的正常含量，提高碱基切除修复能力，对维持DNA的正常活性尤其重要。

本实验中，与空白组比较，小鼠腹腔注射CTX后，骨髓细胞DNA中XRCC1、ADPRT含量均明显降低，经针刺、艾灸治疗后，与模型组比较针刺组、艾灸组骨髓细胞DNA中的XRCC1、ADPRT含量均明显升高。本研究结果揭示，通过针刺和艾灸干预后能够上调CTX化疗小鼠骨髓细胞DNA中，参与BER过程中的核心蛋白XRCC1和ADPRT的表达含量，协同有效地参与碱基切除修复系统，从而提高骨髓细胞DNA碱基切除修复能力，减轻因CTX化疗所致骨髓细胞DNA损伤，减轻骨髓抑制，从BER修复系统为针灸抗骨髓抑制阐释了又一新的分子生物学途径。